扩增子文库的构建方法技术

本发明专利技术公开了一种扩增子文库的构建方法。该构建方法包括以下步骤：S1，对目的片段进行扩增，得到富集目的片段；以及S2，对富集的目的片段进行片段化文库构建，得到扩增子文库；其中，步骤S1包括以下步骤：S11，对目的片段的扩增模板进行定量；S12，对目的片段的扩增引物的退火温度进行固定；以及S13，利用扩增引物在退火温度下对目的片段进行扩增，得到富集目的片段。上述构建方法通过对来自于不同环境的核酸样本进行准确定量扩增体系中的模板量，使得不同样本间目的片段的扩增效率相当，进而降低测序数据的波动性；通过对所用引物的退火温度进行优化，降低扩增子文库中的非特异扩增子的比例，提高了扩增子文库的合格率。

【技术实现步骤摘要】
扩增子文库的构建方法
本专利技术涉及高通量测序领域，具体而言，涉及一种扩增子文库的构建方法。
技术介绍
生命体遗传信息的快速获得对于生命科学的研究有着十分重要的意义。第一代测序仪对电泳分离技术的依赖，使其难以进一步提高分析的速度和并行化程度，也难以通过微型化降低测序成本。经过不断的技术开发和改进，21世纪初，以Roche454技术、illumina公司的GenomeAnalyzer技术和ABI公司的Solid技术为标记的第二代测序技术诞生了。第二代技术大大降低了测序成本，还大幅度提高了测序速度并保持了高准确性。其中，illumina公司的第一台测序仪于2006年问世，之后开发出来一系列的测序仪，如Hiseq2000、Hiseq2500、Miseq、HiseqX等，在准确性、通量、成本和速度方面表现更优秀，而使其成为全球使用量最大的第二代测序仪。在第二代测序平台不断完善的同时，以对单分子DNA进行非PCR测序为主要特征的第三代测序技术也初显端倪。但由于其关键技术问题尚待解决，目前还未得到广泛应用。环境中微生物的群落结构和多样性是微生物生态学的研究热点。微生物多样性的研究涉及农业、土壤、林业、海洋、矿井、人体医学等诸多领域。传统研究手段存在实验操作费时费力、不可培养性、无法检测痕量微生物、无法探索未知等的局限性。第二代高通量测序技术，尤其是illuminaMiseq高通量测序技术的成熟和普及，使我们能够对环境微生物进行深度测序，灵敏地检测环境样品在细菌、真菌、古菌分类方面物种之间的差异，精确指导不同环境微生物的构成。16SrDNA是编码细菌核糖体小亚基的DNA序列，分子大小约1540bp，由9个可变区和10个保守区交叉排列组成。保守区能反映物种间亲缘关系，可变区在不同菌种间存在差异。根据保守区序列设计引物，将可变区扩增出来进行测序，通过测序数据与相应数据库的比对，即可确定微生物在进化树中的位置，从而鉴定样本中可能存在的细菌种类。研究表明，V4靶基因区域(约300bp)对微生物进行分类较为准确。ITS1是位于真核生物的18SrRNA和5.8SrRNA之间的内转录区域，ITS2位于真核生物的5.8SrRNA和28SrRNA之间的内转录区域。由于进化相对于18SrRNA、5.8SrRNA和28SrRNA迅速而具多态性，因而适合于等级水平较低的系统学研究。根据保守区序列设计引物，将其扩增出来进行测序，通过测序数据与相应数据库的比对，即可确定微生物在进化树中的位置，从而鉴定样本中可能存在的真菌种类，是目前非常常见的分析真菌方法。扩增子测序是对特定长度的PCR产物或者捕获的片段进行测序，不仅包括16SrDNA测序，还包括18SrDNA测序、ITS测序及功能基因检测等。采用illuminaMiSeq第二代高通量测序平台对来源于不同环境的样本进行16S/18S/ITS中某个高变区域深度测序，能灵敏地探测出环境微生物群落结构随外界环境的变化而发生的极其微弱的变化，对于我们研究微生物与环境的关系，环境治理和微生物资源的利用有着重要的理论和现实意义。为进行微生物扩增子区域的测序，首先需要对目标样本进行PCR扩增，然后构建适用于二代测序平台的文库。目前的扩增体系主要有20ul和50ul两种，体系中模板量的添加一般为经验值，并没有一个确定的量，波动性较大，对扩增结果也影响较大。同时退火温度则根据引物的不同而不同，一般在50-60℃之间。利用现有扩增技术对上述扩增子进行扩增，合格率低且非特异性条带较多。对于难扩增的ITS1和ITS2区域扩增一般使用的Touchdown技术(65-50℃)，对PCR仪要求较高。因此，仍需要对现有的针对微生物扩增子的扩增方法进行改进，以降低扩增子文库中非扩增子的含量，提高扩增子文库的合格率，降低文库构建成本。
技术实现思路
本专利技术提供了一种微生物扩增子文库的构建方法，以降低扩增子文库中非扩增子的含量，提高扩增子文库的合格率，降低文库构建成本。为了实现上述目的，根据本专利技术的一个方面，提供了一种微生物扩增子文库的构建方法，该构建方法包括以下步骤：S1，对目的片段进行扩增，得到富集的目的片段；以及S2，对富集的目的片段进行片段化文库构建，得到扩增子文库；其中，步骤S1包括以下步骤：S11，对目的片段的扩增模板进行定量；S12，对目的片段的扩增引物的退火温度进行固定；以及S13，利用扩增引物在退火温度下对目的片段进行扩增，得到富集目的片段。进一步地，目的片段为16SV4、ITS1或ITS2。进一步地，当目的片段为16SV4时，扩增引物为SEQIDNO:1所示的正向引物：GTGCCAGCMGMWGCGGTAA；以及SEQIDNO:2所示的反向引物：GGACTACHVGGGTWTCTAAT。进一步地，扩增引物的退火温度为48～52℃，优选为50℃。进一步地，当目的片段为16SV4时，扩增模板为10-20ng。进一步地，当目的片段为ITS1时，扩增引物为SEQIDNO:3所示的正向引物：GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG；以及SEQIDNO:4所示的反向引物：GCTGCGTTCTTCATCGATGC。进一步地，扩增引物的退火温度为55～56℃，优选为55.3℃。进一步地，当目的片段为ITS1时，扩增模板为20-30ng。进一步地，当目的片段为ITS2时，扩增引物为SEQIDNO:5所示的正向引物：GCATCGCATAAGAACGCAGC；以及SEQIDNO:6所示的反向引物：TCCTCCCCATATTGATATGC；优选扩增引物的退火温度为56～58℃，更优选为57.6℃。进一步地，当目的片段为ITS2时，扩增模板为15-50ng。应用本专利技术的技术方案，通过对来自于不同环境的核酸样本进行准确定量扩增体系中的模板量，使得不同样本间目的片段的扩增效率相当，因而使产生的测序数据的波动性降低；通过对所用引物的退火温度进行优化，实现了利用普通PCR仪，经过简单操作，提供了一种目的片段扩增合格率高、非特异条带少的扩增文库构建方法。本专利技术的上述方法不仅降低扩增子文库的构建成本，而且降低扩增子文库中的非特异扩增子的比例，提高了扩增子文库的合格率。附图说明构成本申请的一部分的说明书附图用来提供对本专利技术的进一步理解，本专利技术的示意性实施例及其说明用于解释本专利技术，并不构成对本专利技术的不当限定。在附图中：图1示出了根据本专利技术的一种典型实施方式中扩增子文库构建的流程示意图；图2示出了根据本专利技术的实施例1所提供的16SV4扩增子的电泳检测结果图；图3示出了根据本专利技术的实施例2所提供的ITS1扩增子的电泳检测结果图；以及图4示出了根据本专利技术的实施例3所提供的ITS2扩增子的电泳检测结果图。具体实施方式需要说明的是，在不冲突的情况下，本申请中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。下面将参考附图并结合实施例来详细说明本专利技术。正如
技术介绍
部分所提到的，现有技术的微生物扩增子文库构建方法中，文库构建合格率低且不同样本间测序数据波动性较大的缺陷，为了改善上述状况，在本专利技术一种典型的实施方式中，提供了一种微生物扩增子文库的构建方法，如图1所示，该构建方法包括以下步骤：S1，对目的片段进行扩增，得到富集目的片段；以及S2，对富集的目的片段进行片段化本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种扩增子文库的构建方法，其特征在于，所述构建方法包括以下步骤：S1，对目的片段进行扩增，得到富集的目的片段；以及S2，对所述富集的目的片段进行片段化文库构建，得到所述扩增子文库；其特征在于，所述步骤S1包括以下步骤：S11，对所述目的片段的扩增模板进行定量；S12，对所述目的片段的扩增引物的退火温度进行固定；以及S13，利用所述扩增引物在所述退火温度下对所述目的片段进行扩增，得到所述富集目的片段。

【技术特征摘要】
1.一种扩增子文库的构建方法，其特征在于，所述构建方法包括以下步骤：S1，对目的片段进行扩增，得到富集的目的片段；以及S2，对所述富集的目的片段进行片段化文库构建，得到所述扩增子文库；其特征在于，所述步骤S1包括以下步骤：S11，对所述目的片段的扩增模板进行定量；S12，对所述目的片段的扩增引物的退火温度进行固定；以及S13，利用所述扩增引物在所述退火温度下对所述目的片段进行扩增，得到所述富集目的片段；所述目的片段为16SV4或ITS2,所述16SV4的所述扩增引物为SEQIDNO:1所示的正向引物：GTGCCAGCMGMWGCGGTAA；以及SEQIDNO:2所示的反向引物：GGACTACH...

【专利技术属性】
技术研发人员：王大伟，刘运超，蒋智，李明渊，朱海浩，胡政，
申请(专利权)人：北京诺禾致源生物信息科技有限公司，
类型：发明
国别省市：北京;11