一种新型分子文库及其构建方法技术

本发明专利技术涉及一种新型分子文库及其构建方法，属分子文库技术，涉及分子生物学技术领域。它是由下列步骤构建的：一、设计ＤＮＡ分子库，二、构建ＤＮＡ分子文库；三、ＤＮＡ分子库扩增，四、体外表达。本发明专利技术所构建的分子文库的组成是ＤＮＡ与蛋白质的融合物，可以利用蛋白质部分即表型设计不同的体外筛选策略寻找与目标分子特异结合的分子。筛选时根据分子文库的特点可以选用小分子化合物做靶分子，也可用抗原、抗体、受体、配体等。筛选时可以将靶分子固定在固相载体上，如９６孔板，酶联免疫反应用试管等；也可以不固定而处于自由状态。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属分子文库技术，涉及分子生物学

技术介绍
分子文库是一个大量分子的集合体，它们可以有类似的或不同的来 源，能有效、快速地筛选生物活性物质。分子文库技术操作简单，不需 要特殊的、复杂的仪器设备，在一般的分子生物学或生物化学实验室均 能开展，近年来已成为研究肽和蛋白质等生物活性物质的配体、蛋白质 间相互作用的十分重要的工具。不同的分子文库可以通过不同的策略构建。除用组合化学方法合成 的肽库、小分子化合物库外，主要采用展示技术构建。根据文库呈现的 部位不同，目前已有噬菌体表面展示文库、细菌表面展示文库、质粒展 示文库和核糖体展示文库等。这些分子库为运用分子进化工程探索多肽 和蛋白质的结构与功能提供了有效的手段。例如噬菌体展示技术和核糖 体展示技术常用于发现新配体的研究，而酵母杂交技术则用于分析体内 蛋白质间的相互作用。一般而言，通过建库及由多轮富集和扩增组成的筛选循环，可以从大容量的分子库(1013 1016)中通过几轮筛选找到相应的活性分子，而且从分子文库里找到活性成分的机会与被筛选分子库的库容大小成正 比。但目前的分子文库展示技术中，分子文库的构建及筛选必须通过体 内步骤，转染效率明显限制了库容的扩大。比如噬菌体展示技术构建在细菌中的随机肽库，其库容限制在108 109，而用于双杂交、三杂交的酵母展示系统因其转染效率更低，库容只能达到107。于是，寻找不受细 胞转染和表达等因素影响的完全体外展示系统成为分子文库技术研究的 新方向。根据最新文献检索结果，目前为止体外展示技术方面的研究报道不多。主要有核糖体展示技术和mRNA展示技术。另一个是2003年日本 的一个研究小组提出的利用单分子PCR技术扩增偶联体外转录和翻译技 术所构建的分子文库。(Suang Rungpragayphan, Hideo Nakano， andTsuneo Yamane， PCR-linked in vitro expression: a novel system for high-throughput construction and screening of protein libraries, FEBS Letters 'Volume 540, I^M^J:!, 10 April 2003, Pages 147-150)。但未见后续报道。mRNA展示 技术是目前体外展示技术中的研究较多的一个领域。(Terry T. Takahashi， Ryan J. Austin and Richard W. Roberts, mRNA display: ligand discovery, interaction analysis and beyond, TRENDS in Biochemical Sciences Vol.28 No.3 March 2003)。利用体外展示技术构建分子文库解决了体内展示分子文库转染限制 库容等问题，但目前的体外展示技术中核糖体展示技术和mRNA展示技 术均属RNA展示，由于RNA对RNA酶敏感性使得其操作条件较难控制。 单分子PCR技术虽然属于DNA展示技术但由于蛋白质与其编码的DNA 不是一一对应，使得筛选和回收较难。
技术实现思路
本专利技术提供，目的是利用具有顺式 结合功能的蛋白构建新型分子文库，以解决目前存在的体内歩骤限制文 库库容、现有体外技术操作烦琐、表型与基因型不是一一对应的问题。 本专利技术采取的技术方案是采用基因重组技术、PCR技术等体外技术构 建DNA文库，采用体外转录和翻译系统表达得到DNA与蛋白质共价展6示的分子文库。包括以下步骤一、设计DNA分子库包括编码顺式结合蛋白的基因序列，需要 表达的分子文库的基因序列，以及进一步体外表达所需的启动子、核糖 体结合位点、中止子相应的DNA序列；二、 构建DNA分子文库根据步骤一中DNA分子库的设计，可采 用体外连接、重组及PCR方法构建DNA分子库，具体包括以下步骤(1) .选择含有编码顺式结合蛋白的基因序列的商品化质粒，或在体外通过基因重组将编码顺式结合蛋白的基因序列克隆入载体或质粒；相应的载体或质粒除包含编码顺式结合蛋白的基因序列外，还需包含启动子、核糖体结合位点、中止子；(2) .分子文库的基因序列可根据步骤(l)中所设计的分子文库插入 位置位于顺式结合蛋白的上游还是下游，设计为相应的库引物；(3) .以上述含编码顺式结合蛋白的基因序列、相应启动子、核糖体 结合位点、中止子组件的载体、质粒、或PCR片断为模板，加入库引物 及相对应引物进行PCR反应，即可得到DNA分子库；三、 DNA分子库扩增将步骤二得到的DNA分子库用启动子区的 PCR引物和中止子区的PCR引物进一步进行PCR反应，获得进一步扩 增的DNA分子库；四、 体外表达上述扩增产物即DNA分子库加到适于线性DNA体 外表达的S30提取物中进行DNA体外表达系统，反应后中止反应。得到 的反应后的混合物即为共价展示分子文库。参与细菌环状DNA复制的蛋白具有断裂和连接的双重功能，某些质 粒和噬菌体的启动蛋白在复制过程中还可与断裂的DNA链共价结合。既 此类蛋白质可以使其编码DNA某单链断裂并共价结合在这段序列上，即 形成编码蛋白质的基因与其基因表达产物蛋白的共价结合物。蛋白质的 这一功能称为顺式结合功能。本专利技术利用上述蛋白的顺式结合特性，通过体外操作可以将建库所需的一定长度的DNA序列插入这些蛋白质基因编码DNA的上游或下游， 构建成融合DNA分子库。然后经过无细胞的体外转录和翻译系统进行转 录和翻译，形成基因(含随机序列)与蛋白(含随机序列表达产物)共 价结合复合物，即为新型分子文库。实现本专利技术首先要建立一个可以体外扩增的含相应DNA分子构件 的基因文库即DNA文库。此部分DNA的组成应包括顺式结合蛋白的基 因序列，需要表达的分子文库的基因序列，以及进一步体外表达所需的 启动子、核糖体结合位点等必需组件。其后是上述基因文库的体外表达， 形成蛋白质与其基因直接相连的复合体。上述步骤中用于构建分子文库的DNA分子需要经过体外表达，因此 要求此DNA分子可以被扩增及转录。为保证其可被扩增，适合的核苷酸 序列应是具有复制起始区的双链DNA分子，如具有自我复制能力的质 粒。必要时还可以加入第二个复制起始位点。 一般情况，建库的核苷酸 分子可以以载体、质粒、及线性DNA的形式存在。上述载体、质粒、或 线性DNA可以选用商品化产品加以改造，亦可通过常规的分子生物学操 作进行克隆及重组。DNA分子的扩增一般采用聚合酶链式反应(PCR)。 为保证构建分子文库的DNA分子可以被用于转录需要引入相应启动子 序列，根据需要可选用可诱导型启动子或非诱导型启动子。可诱导型启 动子包括AraB， Lamda启动子，TAC或LAC。非诱导型启动子如 T7启动子，SP6或T3启动子。本专利技术的基因文库上述核苷酸序列的组建可以采用体外连接、PCR 扩增等方法，但不限于此。为增加分子文库的多样性可采用随机引物、 超大引物、重叠引物等PCR策略。分子文库序列可以在顺式结合蛋白编 码区的任何位置，如氨基端、羧基端、或编码区内部。如果插入到氨基 端，且通过引物引入，需采用含适合启动子，起始区编码等本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种新型分子文库，其特征在于它是由下列步骤构建的：　一、设计ＤＮＡ分子库：包括编码顺式结合蛋白的基因序列，需要表达的分子文库的基因序列，以及进一步体外表达所需的启动子、核糖体结合位点、中止子相应的ＤＮＡ序列；　二、构建ＤＮＡ分子 文库：根据步骤一中ＤＮＡ分子库的设计，可采用体外连接、重组及ＰＣＲ方法构建ＤＮＡ分子库，具体包括以下步骤：　（１）．选择含有编码顺式结合蛋白的基因序列的商品化质粒，或在体外通过基因重组将编码顺式结合蛋白的基因序列克隆入载体或质粒；相应 的载体或质粒除包含编码顺式结合蛋白的基因序列外，还需包含启动子、核糖体结合位点、中止子；　（２）．分子文库的基因序列可根据步骤（１）中所设计的分子文库位置插入位置位于顺式结合蛋白的上游还是下游，设计为相应的库引物；　（３）．以上 述含编码顺式结合蛋白的基因序列、相应启动子、核糖体结合位点、中止子组件的载体、质粒、或ＰＣＲ片断为模板，加入库引物及相对应的引物进行ＰＣＲ反应，即可得到ＤＮＡ分子库；　三、ＤＮＡ分子库扩增：将步骤二得到的ＤＮＡ分子库用启动子区的ＰＣＲ 引物和中止子区的ＰＣＲ引物进一步进行ＰＣＲ反应，获得进一步扩增的ＤＮＡ分子库；　四、体外表达：上述扩增产物即ＤＮＡ分子库加到适于线性ＤＮＡ体外表达的Ｓ３０提取物中进行ＤＮＡ体外表达系统，反应后中止反应。得到的反应后的混合物即为共价展示 分子文库。...

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：曹文华，
申请(专利权)人：吉林大学，
类型：发明
国别省市：82[中国|长春]