【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物医药，即同时靶向atf和cd340两种肿瘤抗原的car-t淋巴细胞的制备及其在上皮性卵巢癌治疗中的用途。
技术介绍
1、卵巢癌是妇科致死率最高的恶性肿瘤，严重影响女性身心健康，给社会带来沉重经济负担，是妇产科的研究热点，也是尚未攻克的难点。卵巢癌的传统治疗方法包括根治性手术切除、化疗以及靶向治疗，尽管这些方法延长了生存期，但复发率仍然较高，全球范围内数据显示5年生存率不足50%。近年来，免疫治疗技术的发展为改善卵巢癌治疗效果提供了新方向。
2、嵌合抗原受体t细胞（chimeric antigen receptor t cell, car-t cell）疗法是一种新型、有前景、可能治愈恶性肿瘤的免疫治疗方法。简单地说，car-t细胞由car和t淋巴细胞两部分构成，car的作用是特异性识别和结合肿瘤细胞，而t淋巴细胞的作用是杀伤肿瘤细胞，二者组合后完成靶向杀伤肿瘤细胞。car-t细胞疗法在复发或难治性大b细胞淋巴瘤成人患者中已进入临床应用阶段，2021年6月23日我国国家监督管理局批准了首个car-t细胞制剂（阿基仑赛注射液）上市。但是，多项car-t细胞疗法治疗卵巢癌的临床试验结果显示效果不容乐观，经常出现药物不良反应和并发症，主要体现在，细胞因子风暴、肿瘤抗原逃逸、难以归巢和定殖、脱靶效应和免疫抑制肿瘤微环境，这些问题将直接影响car-t细胞的治疗效果。另外，不同病理类型卵巢癌表达的肿瘤抗原类型存在差异，因此，选择恰当的肿瘤抗原对于car-t细胞的疗效至关重要。atf是尿激酶型纤溶酶原激活物受体的自
3、为了解决car-t细胞在卵巢癌治疗中的肿瘤抗原逃逸和难以归巢和定殖问题，我们构建了一种新型、双靶向、串联、第三代atf/cd340-car-t细胞，以期提高car-t细胞靶向杀伤上皮性卵巢癌的效果，为临床转化和应用提供理论依据。
技术实现思路
1、本专利技术提供了一种同时靶向两个肿瘤抗原的car-t细胞制剂治疗上皮性卵巢癌的新用途，并证明了其应用结果。尽管本专利技术专利以杀伤上皮性卵巢癌为例，该药物同样适用于表达atf和/或cd340抗原的其他癌症，例如食管腺癌、鳞状细胞瘤、胰腺癌、乳腺癌、前列腺癌、结直肠癌等。
2、一种同时靶向两种肿瘤抗原atf和cd340的car-t细胞制剂的优点如下：第一，靶抗原的选择，靶抗原直接决定了car-t细胞抗卵巢癌的效应性，本专利技术专利择了atf和cd340抗原作为靶抗原，并找到了同时过表达这两种肿瘤抗原的es-2细胞；第二，双靶向car-t细胞的构建，双靶向car-t细胞提高了对肿瘤细胞靶抗原的识别能力；第二，双靶向car-t细胞降低了细胞因子风暴的风险，避免因免疫疗法所致的相关并发症。
3、专利申请人研究发现同时双靶向atf和cd340抗原的car-t细胞可以增强t淋巴细胞对上皮性卵巢癌的识别、结合以及杀伤作用。重要的是，本专利技术专利构建的car-t细胞为第三代、双靶向、串联的car结构，理论上具有更高的生物安全性，而且通过增加共刺激结构域改善t淋巴细胞效能。因此，上述多项优势组合，发挥序贯交互协同作用。
4、atf和cd340肿瘤相关抗原在上皮性卵巢癌细胞（es-2细胞）表面呈高表达，但是在正常组织细胞中表达量却很少，这为car-t细胞提供了结合靶点。atf和cd340抗原同样高表达于食管癌、胃癌、胰腺癌、乳腺癌、前列腺癌、膀胱癌、结肠癌和肝癌等恶性肿瘤。因此，第三代、双靶向、串联的atf/cd340-car t细胞制剂同样适用于这些恶性肿瘤，但不限于此，在癌症的预防和治疗中有广泛的应用前景。
5、本专利构建了一种双靶向、串联、第三代的atf/cd340-car结构，核苷酸序列为seqid no.1。
6、atf/cd340-car结构包括胞外结构域、跨膜区和胞内结构域。具体而言，胞外结构域由识别尿激酶型纤溶酶原激活物受体的自然结合片段（atf）、cd340的scfv、cd8α leader以及cd8α铰链区组成；跨膜区由为cd8α构成；胞内结构域由cd28共刺激结构域、cd137共刺激结构域以及cd3ζ胞内信号区共同组成。
7、cd8α leader为atf/cd340-car中的嵌合受体信号肽，核苷酸序列为seq id no.2。
8、atf-能够识别、结合和杀伤肿瘤表达的相关抗原，其核苷酸序列为seq id no.3。
9、cd340 scfv为atf/cd340-car中的靶向恶性肿瘤细胞表面cd340抗原的人源化单链抗体，具有较高的安全性，避免引起人机体的免疫反应的优点，核苷酸序列为seq idno.4。
10、cd8α-hinge/cd8α tm为atf/cd340-car中的铰链区和跨膜区，核苷酸序列为seqid no.5。
11、cd28为atf/her-car中的胞内的共刺激结构域，具有抗原提呈、促进t淋巴细胞活化和分泌抗肿瘤的细胞因子的作用，核苷酸序列为seq id no.6。
12、cd137为atf/cd340-car中的胞内的另一个共刺激结构域，与cd28共刺激结构域相似，也具有抗原提呈、促进t淋巴细胞活化和分泌抗肿瘤的细胞因子的作用，核苷酸序列为seq id no.7。
13、cd3ζ为atf/cd340-car中的胞内信号区，具有提呈信号活化t淋巴细胞的作用，核苷酸序列为seq id no.8。
14、atf/cd340-car及其载体的核苷酸序列为seq id no.9。
15、atf/cd340-car t细胞中的t淋巴细胞可以来源于自体t淋巴细胞、异体t淋巴细胞或多能干细胞诱导的t淋巴细胞。上述来源的多种t淋巴细胞中，来自患者自体t淋巴细胞为首选，这有利于降低免疫反应的发生率和副作用。由于卵巢癌等恶性肿瘤细胞表面的atf和cd340抗原高表达，而正常组织细胞表明的atf和cd340抗原呈低表达，因此单靶向atf或cd340抗原的car-t细胞仍有攻击正常组织细胞的可能性，导致患者出现细胞因子风暴等并发症，严重者导致患者死亡。本专利技术中构建的第三代、双靶向、串联结构的car t细胞，经过“逻辑门”设计，即两种抗原（atf和cd340）同时被识别时才能杀伤肿瘤细胞，而仅一种抗原（atf或cd340）被识别时对肿瘤细胞无杀伤作用，两种抗原都未被识别时，也无肿瘤杀伤作用，该设计有效避免了而又避免正常组织细胞受到攻击，又保证了抗肿瘤作用。
16、本专利技术提供了一种治疗上皮性卵巢癌、食管腺癌、鳞状细胞瘤、胰腺癌和乳腺癌等多种恶性肿瘤的药物，所述药物的成分为atf/cd340-car t细胞制剂，该药物使用方本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种同时靶向两种肿瘤抗原的CAR-T细胞治疗上皮性卵巢癌的药物，其特征在于：所述药物的成分为ATF/CD340-CAR T细胞制剂，其结构为双靶向、串联、第三代的ATF/CD340-CAR结构，核苷酸序列为SEQ ID No.1。
2.如权利要求1所述的药物，其特征在于：
3.如权利要求2所述的药物，其特征在于：
4.如权利要求2所述的药物，其特征在于：
5.如权利要求2所述的药物，其特征在于：
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【技术特征摘要】
1.一种同时靶向两种肿瘤抗原的car-t细胞治疗上皮性卵巢癌的药物，其特征在于：所述药物的成分为atf/cd340-car t细胞制剂，其结构为双靶向、串联、第三代的atf/cd340-car结构，核苷酸序列为seq id no.1。
2.如权利要求1所述的药物，其特征在于：
3.如权利要求2所述的药物，其特征在于：
4.如...
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