选定分子的导入方法技术

本发明专利技术提供可将多种多样的选定分子高效地导入多种多样的细胞中的方法，以及融合细胞的方法。通过将细胞和／或多核苷酸等选定分子用低温气体等离子体处理，将存在于细胞附近的选定分子导入细胞内，或通过用低温气体等离子体处理细胞，使细胞融合。本发明专利技术进一步提供用于导入选定分子或细胞融合的装置，所述装置具有用于将选定分子导入细胞的低温气体等离子体发生装置。（*该技术在2022年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及将基因等多核苷酸、蛋白质、生理活性分子等选定分子导入细胞内的方法和细胞的融合方法或实施这些方法的装置。
技术介绍
近年来，在医学、药学等领域进行基因工程和药物开发时，将基因等多核苷酸、蛋白质、生理活性分子、候选药物等选定分子导入细胞内，用细胞测试基因的功能和生理活性分子的生理活性的需要增多。目前，作为导入选定分子的方法，可以采用电穿孔方法、基因枪方法、脂质体方法、细胞融合方法、病毒载体方法等方法，但这些方法未必能充分地将选定分子导入细胞。电穿孔方法和基因枪方法可应用于多种细胞，但操作繁杂，难以实现HTS；另外，脂质体方法有可应用的细胞有限的问题。并且，这些方法费用都很高，因而，即使可以实现HTS，也是非常昂贵的。况且，很多情况下导入效率也未尽人意。目前已完成人和小鼠基因序列的解读，对功能尚未知晓的基因进行功能分析已成当务之急，其中，开发可实现HTS的基因导入方法是必不可少的。在实现HTS的过程中，也急需开发出不是向特定的细胞导入基因，而是向各种细胞中均可高效地导入基因的方法，以便可以高效率地对各种基因的功能进行分析。本专利技术的目的在于解决上述问题，提供高效率地向多种细胞中导入选定分子的方法和细胞的融合方法。专利技术的公开本专利技术人发现，用低温气体等离子体处理细胞和/或选定分子，可将存在于细胞附近的选定分子导入细胞内，从而完成了本专利技术。并进一步发现用低温气体等离子体处理细胞，细胞发生了融合。即，本专利技术的内容如下所示。一种将选定分子导入细胞的方法，所述方法包括通过用低温气体等离子体处理细胞和/或选定分子，将存在于细胞附近的选定分子导入细胞内。的，所述方法包括是预先将选定分子置于细胞附近，然后进行细胞的低温等离子体处理。或的，其中所述选定分子是多核苷酸。通过用等离子体处理细胞，使细胞融合的方法。一种装置，所述装置以细胞和/或选定分子为靶，通过用低温气体等离子体处理，可以将存在于细胞附近的选定分子导入细胞内；或通过用等离子体处理细胞，可使细胞融合。的装置，所述装置具有借助开放式放电的低温气体等离子体发生装置。本专利技术中的选定分子是指选定供导入目标细胞用的的分子。这样的选定分子包括DNA、RNA等多核苷酸或其衍生物；信号转导蛋白和转录调控因子等蛋白质及其衍生物等高分子化合物；小分子生理活性物质；候选药物。在这些选定分子中，优选多核苷酸及其衍生物。本专利技术中的细胞是导入选定分子的目标细胞，并无特别限定。这些细胞有例如大肠杆菌、放线菌、枯草杆菌等原核细胞；酵母、动物细胞、植物细胞等真核细胞。另外，红细胞血影和脂质体等具有脂双层膜结构的也包括在本专利技术所述的细胞中。为了提高向这些细胞导入选定分子的效率，可以使用根据导入基因时常用的制备感受态细胞的方法制备的细胞。另外，可以通过与其他的基因导入方法组合，例如与使用脂转染胺试剂(Lipofectamin，GIBCO-BRL公司制造)等阳离子型脂质和脂质体的脂质体方法等组合，来进一步提高选定分子导入细胞的效率。本专利技术中，所使用的低温气体等离子体(低温非平衡式等离子体、低温弱电离等离子体)可以通过例如电晕放电而发生，但可根据发生装置的类型和发生条件而改变其性质。可以根据所用细胞和选定分子、操作的环境等，适当选择实施本专利技术所使用的等离子体的气体的种类、等离子体密度、电子温度、处理时间等。低温气体等离子体中使用的气体种类优选选自氧气、空气、二氧化碳、氮气、氩气中的至少一种。本专利技术使用的低温气体等离子体发生装置可以采用密闭型、开放型中任一种的发生装置，但从细胞处理的简便性来看，优选为开放型装置。本专利技术装置的具体例子有例如附图说明图1所示类型的装置。该装置由电气系统和气体系统构成，可以通过电气系统的信号发生器、线性放大器、匹配电路、升压变压器，将电极间电压、电极间距、频率、脉冲周期、Duty等参数设定成各种条件，并在该条件下在突出部分(head)放电，产生各种等离子体。另一方面，在气体系统中，由气体钢瓶或气泵提供的单一气体或混合气体，通过针阀设定为适当的流量，供给突出部分。突出部分生成的等离子体由气体吹出，来照射设置在前方的试样。为了在适合于细胞、各类生物或选定分子(包括基因、低分子、蛋白等)等每种试样的条件下进行等离子体照射，通过改变上述条件来改变等离子体及其照射条件的设定。本专利技术的具体实施方案有例如将在平板等细胞培养容器中培养的粘附型细胞，或者通过离心或过滤等操作将收集的细胞除去培养液，然后向其细胞表面加入少量含有选定分子的溶液。之后利用等离子体发生器产生的等离子体进行等离子体处理。等离子体处理的时间根据各种条件不同而不同，大致为数秒～数十秒。等离子体处理后，加入培养基进行培养。当选定分子是含有基因等的载体时，可有效地进行基因重组试验；当选定分子是例如定向于细胞内靶分子的候选药物时，可有效地进行候选药物的筛选。附图简述图1是本专利技术的用于导入基因或细胞融合的装置模式图。图2是显示本专利技术的用于导入基因或细胞融合的装置的等离子体发生部(电极部)与试样关系的模式图。图3、图4和图5显示通过光谱法测定本专利技术的实施例所使用的、用于基因导入或细胞融合的装置在各种条件下发生的等离子体的结果。测定采用大冢电子制造的摄谱仪MCPD-3000，探头设置于距等离子体约3cm处，以获得等离子体的光谱。实施专利技术的最佳方式下面，通过实施例进一步具体地说明本专利技术，但本专利技术并不受该实施例1根据图1制作本专利技术的装置。该装置中等离子体照射仪的条件如下电极间电压kV～十几kV；电极间距10～15mm；频率20～40kHz；脉冲周期30～90Hz；工作比25～100％；在气体分别为空气、氮气、氧气、二氧化碳、氩气、氦气∶空气＝1∶1等条件下照射约1～5秒。电极至试样的距离在约1～3之间选择适当的条件。通过该装置可以产生例如具有图3～图5所示光谱的等离子体。通过该等离子体发生装置进行基因导入。将中国仓鼠肺成纤维细胞CHL细胞接种于直径60mm的细胞培养平板上，在37℃、5％二氧化碳的条件下培养过夜。每孔接种1×106个培养细胞后开始培养。确认细胞已很好地粘附在平板上之后，从培养平板上除去培养基，向细胞表面加入110μl GFP表达质粒溶液(1μg/μl)，在各种条件下，用本专利技术的装置进行等离子体照射。等离子体照射之后，立即加入培养基，培养过夜，用荧光显微镜观察GFP蛋白的表达，计数每个视野内的表达细胞数。另外，用FACS Flow cytometry(荧光激活细胞分类流式细胞仪)计数孔内所有细胞中的GFP蛋白表达细胞。结果，在每种条件下均观察到GFP的表达。通过显微镜目测，导入效率最高为约60％，通过FACS测定，约为5～25％。另外，同类型的装置，市场上已有KEYENCE公司的等离子体照射仪ST-7000销售，该装置可以产生具有图5所示光谱的等离子体，因而可用于本专利技术的目的。实施例22-1)向粘附型动物确立细胞株的导入将动物确立细胞接种于6孔平板，在37℃、5％二氧化碳的条件下培养过夜。每孔接种的培养细胞数为若为中国仓鼠肺成纤维细胞则是1×106个，若为来源于人体子宫癌的Hela细胞则是2.5×105个，然后开始培养。确认细胞已很好地粘附在平板上之后，从培养平板上除去培养基，向细胞表面加入50μl GF本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种选定分子的导入方法，所述方法包括将选定分子导入细胞的方法，通过将细胞和／或选定分子用低温气体等离子体处理，将存在于细胞附近的选定分子导入细胞内。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：三好荘介，大久保聪子，森川记行，小川恭弘，西村伸太郎，深川正夫，荒川弘之，善光纯子，佐藤晋，
申请(专利权)人：藤泽药品工业株式会社，
类型：发明
国别省市：JP[日本]