一种胎盘干细胞库的构建方法及胎盘组织复苏方法技术

一种胎盘干细胞库的构建方法及胎盘组织复苏方法，它涉及一种胎盘干细胞库建立方法。本发明专利技术的干细胞库构建方法为：将至少3个部位的胎盘组织经过无菌清洗处理后，组织剥离、进一步消毒、剪细、冷冻剂保护，程序化冷冻、深低温暂存、液氮罐长期保存等步骤，长期保存了具有生物学活性的胎盘组织。此方法保存的胎盘组织可应用于胎盘干细胞库的建立，根据所需要细胞种类进行选择组织部位复苏后复苏、酶消化、培养、扩增、质量检验等，以便获得胎盘羊膜上皮细胞、胎盘羊膜间充质、胎盘绒毛膜间充质干细胞、胎盘底蜕膜间充质干细胞等。本发明专利技术的方法简化操作步骤，减少人工干预错误，提高效率、保存了多种干细胞资源、为未来个性化干细胞定制提供基础。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种胎盘干细胞库的构建方法及胎盘组织复苏方法。
技术介绍
胎盘是宝宝赖以生存的各种营养物质输送的纽带，由羊膜、绒毛膜和底蜕膜构成。羊膜和绒毛膜来源于胎儿，底蜕膜则起源于母体。胎盘除在胎儿发育、营养支持和维持耐受中发挥重要作用外，还是一个机体的干细胞储备库。胎盘中有多种多能干细胞，目前已知的至少有三类胎盘干细胞。胎盘中第一类多能干细胞为间充质干细胞(Mesenchymal stem cells，MSCs)，MSCs是一类能够自我更新，具有多向分化能力的多能干细胞，可以分化为骨、软骨、脂肪、神经和肝细胞等组织细胞。胎盘MSCs能抑制免疫和促进造血重建的特性，使其在造血干细胞移植及移植后GVHD防治方面具有良好的应用前景。由于胎盘来源MSCs与骨髓来源MSCs相比具有组织来源广和细胞增殖能力强的优势，使其具有更好的临床应用前景。胎盘MSCs至少可以分为3种，绒毛膜MSCs、羊膜MSCs，还包括来自母体的底蜕膜组织的MSCs，通过对绒毛层和底蜕膜MSCs的免疫标记检测，发现它们均表达典型的MSCs表面抗原CD13、CD29、CD44、CD54、CD73、CD105，不表达造血干细胞表面抗原CD3、CD14、CD34、CD45和内皮细胞表面抗原CD31。通过检测发现，绒毛膜MSCs还弱表达胚胎干细胞类表面抗原SSEA-4，而羊膜MSCs表达典型的MSCs表面抗原外，还表达胚胎干细胞类的表面标志物Oct-4。而底蜕膜作为母-胎界面的组成部分之一，为母体面，意味着来源于底蜕膜的MSCs可作为母亲来源的干细胞的一种。胎盘中的第二类多能干细胞为羊膜上皮细胞(human amniotic epithelial cells,hAECs)。人hAECs作为一种干细胞，表达多种胚胎干细胞类标志物，包括SSEA-4、SSEA-3、TRA-1-60、TRA-1-80，hAECs表达多潜能干细胞特定的转录因子OCT-4和Nanog基因。同时具有向心肌、肝、神经细胞以及胰岛细胞等多系分化的潜力，因此人hAECs是介于胚胎干细胞和成体干细胞之间的一个中间等级的干细胞。研究中表明，hAECs不表达HLA-A、B、C、DR等人类白细胞抗原具有免疫赦免性，移植后可以避免免疫排斥反应的发生，具有非常广泛的临床应用前景，近年来收集和保存羊膜上皮细胞也成为未来进行临床应用创造了条件。胎盘中的第三类干细胞为胎盘造血干细胞(human placenta-derived hemopoietic stem cells,hPD-HSCs)。hPD-HSCs是通过剪切胎盘胎儿面组织成0.5mm3的组织块，经中性蛋白酶、胰蛋白酶及胶原酶等进行组织消化，或者经CXCR-4受体阻滞剂AMD3100加入灌注液灌注法获得中间层单个核细胞。其CD34、CD133等造血干细胞表明抗原表达均为阳性。与流动的脐带血相比，胎盘组织间隙中的hPD-HSCs中CD34阳性细胞是脐带血中的数倍，胎盘CD34+CD38+hPD-HSCs亚群细胞分化形成的粒细胞单核细胞集落、爆红型集落、混合型集落数均明显高于脐带血造血干细胞。hPD-HSCs的临床应用价值类似于脐带血造血干细胞，可以在治疗血液疾病，如急慢性白血病、再生障碍性贫血、地中海贫血和淋巴瘤等方面有较好的效果，是一个可以补充脐带血造血干细胞数量不足的重要干细胞资源。目前，国内外针对胎盘干细胞储存方式为单一部位取样，然后体外培养扩增，达到一定数量后进行深低温冻存。这种方式只进行了胎盘组织中一种干细胞的扩增、培养，而大部分干细胞没有能够得到保存。本专利技术提供了一种胎盘干细胞库构建方法，本方法保存了至少3个胎盘组织部位(包括但不限于羊膜、绒毛膜、胎盘底蜕膜)，也保存了目前已知的多种干细胞，同时，对胎盘组织中目前未知的、将来可能发展应用潜力更大的干细胞也进行了保存，此方法简化操作步骤、提高效率、且保存了多种干细胞资源，为未来定制化干细胞分离、培养、扩增奠定了基础。
技术实现思路
本专利技术是为胎盘组织的不同部位保存提供可靠的方法，此方法用于胎盘干细胞库建立，分离不同功能的干细胞，延长胎盘组织的保存时间，保证组织内细胞不受影响，保证组织细胞的活性，操作方法简单，复苏后可直接用于干细胞分离培养。本专利技术应用胎盘组织的冻存方法，将胎盘不同部位组织剥离后分别剪小至0.5～1mm3大小，加入配置好并提前遇冷的冻存液重悬后，分装于冻存管内，4℃温度下平衡30min，转入-80℃冰箱内过夜，最终置于液氮中长期保存，根据所需要细胞种类分别进行复苏用于细胞培养。本专利技术的一种胎盘干细胞库构建方法，它是按照以下步骤进行：一、胎盘采集：采集留有3～5cm脐带的完整胎盘，备用；二、胎盘组织预处理：取步骤一至少3个部位的胎盘组织分别采用组织剪、钳进行仔细剥离、收集，收集后的组织分别用生理盐水洗净血液、剪小至0.5～1mm3大小，分别用生理盐水清洗2～3遍，其中，每次清洗后在1300rpm转速下离心6min，收集沉淀，继续下一次清洗；清洗结束后，收集沉淀备用；三、组织块冻存液配制：所述冻存液每1mL是由0.68～0.72mL DMEM、0.07～0.12mL胎牛血清、0.01～0.02mL L-谷氨酰胺和0.2mL二甲基亚砜组成，配制好后于4℃预冷保存；或者组织块冻存液采用无血清培养基进行配制；四、组织程序化冻存：将步骤二预冷保存的组织块用0.5倍组织块体积的培养基重悬配成组织悬液，再加入0.5～1.5倍组织悬液体积的步骤三配制的冻存液，然后分装至冻存管内，首先在程控降温盒中4℃平衡30min，然后转入-80℃过夜暂存；五、对每一个冻存管设低温防冻条码，进行管理；六、对步骤二的预处理后的胎盘组织样本和步骤五复苏的胎盘组织进行厌氧菌、需氧菌、霉菌、乙肝病毒、丙肝病毒、艾滋病毒和梅毒检测；将检测结果全部为阴性的胎盘组织转入-150℃～-180℃液氮罐气相中长期保存，即构建出胎盘干细胞库。本专利技术的一种胎盘干细胞库的胎盘组织复苏方法，它是按照以下步骤进行的：一、首先从权利要求1构建的胎盘干细胞库中取出冻存管放在37℃～40℃水浴中1～2min进行解冻；二、将步骤一解冻后的胎盘组织放入洁净的离心管中，加入2～3倍体积的DMEM混匀，然后在4℃温度、转速为1300转/分钟的条件下离心6min，去上清收集固相物，重复离心操作2～3次，收集固相物；三、将步骤二收集的固相物接种到T75培养瓶中，加入DMEM培养液后置于CO2培养箱内培养2天后，计算贴壁组织块数量和悬浮组织块数量；通过本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种胎盘干细胞库构建方法，其特征在于它是按照以下步骤进行：一、胎盘采集：采集留有3～5cm脐带的完整胎盘，备用；二、胎盘组织预处理：取步骤一至少3个部位的胎盘组织分别采用组织剪、钳进行仔细剥离、收集，收集后的组织分别用生理盐水洗净血液、剪小至0.5～1mm3大小，分别用生理盐水清洗2～3遍，其中，每次清洗后在1300rpm转速下离心6min，收集沉淀，继续下一次清洗；清洗结束后，收集沉淀备用；三、组织块冻存液配制：所述冻存液每1mL是由0.68～0.72mL DMEM、0.07～0.12mL胎牛血清、0.01～0.02mL L‑谷氨酰胺和0.2mL二甲基亚砜组成，配制好后于4℃预冷保存；或者组织块冻存液采用无血清培养基进行配制；四、组织程序化冻存：将步骤二预冷保存的组织块用0.5倍组织块体积的培养基重悬配成组织悬液，再加入0.5～1.5倍组织悬液体积的步骤三配制的冻存液，然后分装至冻存管内，首先在程控降温盒中4℃平衡30min，然后转入‑80℃过夜暂存；五、对每一个冻存管设低温防冻条码，进行管理；六、对步骤二的预处理后的胎盘组织样本和步骤五复苏的胎盘组织进行厌氧菌、需氧菌、霉菌、乙肝病毒、丙肝病毒、艾滋病毒和梅毒检测；将检测结果全部为阴性的胎盘组织转入‑150℃～‑180℃液氮罐气相中长期保存，即构建出胎盘干细胞库。...

【技术特征摘要】
1.一种胎盘干细胞库构建方法，其特征在于它是按照以下步骤进行：
一、胎盘采集：采集留有3～5cm脐带的完整胎盘，备用；
二、胎盘组织预处理：取步骤一至少3个部位的胎盘组织分别采用组织剪、钳进行仔
细剥离、收集，收集后的组织分别用生理盐水洗净血液、剪小至0.5～1mm3大小，分别用生
理盐水清洗2～3遍，其中，每次清洗后在1300rpm转速下离心6min，收集沉淀，继续下一
次清洗；清洗结束后，收集沉淀备用；
三、组织块冻存液配制：所述冻存液每1mL是由0.68～0.72mL DMEM、0.07～0.12mL胎
牛血清、0.01～0.02mL L-谷氨酰胺和0.2mL二甲基亚砜组成，配制好后于4℃预冷保存；或
者组织块冻存液采用无血清培养基进行配制；
四、组织程序化冻存：将步骤二预冷保存的组织块用0.5倍组织块体积的培养基重悬
配成组织悬液，再加入0.5～1.5倍组织悬液体积的步骤三配制的冻存液，然后分装至冻存管
内，首先在程控降温盒中4℃平衡30min，然后转入-80℃过夜暂存；
五、对每一个冻存管设低温防冻条码，进行管理；
六、对步骤二的预处理后的胎盘组织样本和步骤五复苏的胎盘组织进行厌氧菌、需氧
菌、霉菌、乙肝病毒、丙肝病毒、艾滋病毒和梅毒检测；将检测结果全部为阴性的胎盘组
织转入-150℃～-180℃液氮罐气相中长期保存，即构建出胎盘干细胞库。
2.根据权利要求1所述的一种胎盘干细胞库构建方法，其特征在于所述的胎盘干细胞
库包含胎盘绒毛膜间充质干细胞、胎盘羊膜间充质干细胞、胎盘底蜕膜间充质干细胞和胎
盘羊膜上皮细胞四种干细胞。
3.根据权利要求1所述的一种胎盘干细胞库构建方法，其特征在于步骤一中采集后的
胎盘用无菌生理盐水冲洗表面血液后置于无菌生物样本采样袋内，在4～25℃采集箱内运输，
采集箱运输过程要求控制温度恒定，防止颠簸，采集的胎盘需在72小时内进行处理。
4.根据权利要求1所述的一种胎盘干细胞库构建方法，其特征在于所述冻存液每1mL
是由0.70mL DMEM、0.10mL胎牛血清、0.15mL L...

【专利技术属性】
技术研发人员：张怡，王灵娟，付寅生，刘艳青，
申请(专利权)人：黑龙江天晴干细胞股份有限公司，
类型：发明
国别省市：黑龙江;23