一种通用型慢病毒载体及其制备方法技术

一种通用型慢病毒载体及其制备方法，涉及一种慢病毒载体及其其制备方法。本发明专利技术是要解决目前CAR‑T制备中过程中载体构建步骤烦琐、耗时过长，慢病毒载体无法通用，成本高的问题。该慢病毒载体以pCDH‑CMV‑MCS‑EF1‑Puro质粒为骨架，向质粒骨架的多克隆位点MCS处插入以下元件：CD8α Leader DNA序列、CD8α铰链区、CD28跨膜区‑胞内区、CD137胞内区和CD3ζ。方法：一、引物设计；二、外周血单个核细胞的获得、激活；三、mRNA的提取及RT反应；四、重组质粒制备；五、合成单链CD8α Leader DNA序列；六、将线性载体、目的基因片段及CD8α Leader片段连接，即得到通用型慢病毒载体。本发明专利技术用于制备慢病毒载体。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种慢病毒载体及其其制备方法。
技术介绍
T淋巴细胞是肿瘤细胞的天敌，在肿瘤免疫应答中起主要作用，对肿瘤细胞有极强的杀伤作用。但是，使用内源性T细胞进行肿瘤免疫治疗时，靶抗原需经过加工处理后才能和靶细胞表面的主要组织相容性复合物(main histocompatibility complex,MHC)作用，也就是存在我们常说的“MHC限制性”。然而，肿瘤免疫编辑的过程会使MHC在肿瘤细胞表面表达下降，破坏抗原加工过程，降低肽段免疫原性。这样长期形成的免疫逃逸机制，能使肿瘤细胞成功躲避T细胞攻击，肿瘤快速增殖。过继性细胞免疫治疗(adoptive cellular immunotherapy,ACI)是目前较为有效的恶性肿瘤的治疗方法之一。随着技术的日趋成熟，已在多种实体瘤和血液肿瘤的临床治疗中取得较好疗效。其中，嵌合抗原受体(chimeric antigen receptor,CAR)T细胞技术是近年来发展非常迅速的一种细胞治疗技术。通过基因改造技术，效应T细胞的靶向性、杀伤活性和持久性均较常规应用的免疫细胞高，并可克服肿瘤局部免疫抑制微环境和打破宿主免疫耐受状态。目本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种通用型慢病毒载体，其特征在于该慢病毒载体以pCDH‑CMV‑MCS‑EF1‑Puro质粒为骨架，向质粒骨架的多克隆位点MCS处插入以下元件：CD8αLeader DNA序列、CD8α铰链区、CD28跨膜区‑胞内区、CD137胞内区和CD3ζ；其中CD8αLeader DNA序列如序列表中SEQ ID NO：1所示，CD8α铰链区如序列表中SEQ ID NO：2所示，CD28跨膜区‑胞内区如序列表中SEQ ID NO：3所示，CD137胞内区如序列表中SEQ ID NO：4所示，CD3ζ如序列表中SEQ ID NO：5所示。

【技术特征摘要】
1.一种通用型慢病毒载体，其特征在于该慢病毒载体以pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro质粒为骨架，向质粒骨架的多克隆位点MCS处插入以下元件：CD8αLeader DNA序列、CD8α铰链区、CD28跨膜区-胞内区、CD137胞内区和CD3ζ；其中CD8αLeader DNA序列如序列表中SEQ ID NO：1所示，CD8α铰链区如序列表中SEQ ID NO：2所示，CD28跨膜区-胞内区如序列表中SEQ ID NO：3所示，CD137胞内区如序列表中SEQ ID NO：4所示，CD3ζ如序列表中SEQ ID NO：5所示。2.如权利要求1所述的通用型慢病毒载体的制备方法，其特征在于该方法具体步骤如下：一、引物设计：设计CD8α铰链区、CD28跨膜区-胞内区、CD137胞内区及CD3ζ的上游引物和下游引物，分别命名为：CD8αF/CD8αR、CD28F/CD28R、CD137F/CD137R、CD3ζF/CD3ζR；二、外周血单个核细胞的获得、激活：采集成人外周血，提取外周血单个核细胞，将外周血单个核细胞用含10％FBS和1000IU/ml IL-2的RPMI1640培养基重悬并稀释至1×106/ml-1.5×106/ml，取2ml稀释液加入至事先用包被液包被好的6孔板中，刺激20-28h。三、mRNA的提取及RT反应：提取步骤二激活后的PBMC的RNA，并进行反转录成cDNA；四、以cDNA为模板，用引物CD8αF/CD8αR、CD28F/CD28R、CD137F/CD137R和CD3ζF/CD3ζR分别进行PCR扩增，获得CD8α铰链区、CD28跨膜区-胞内区、CD137胞内区及CD3ζ基因，胶回收纯化后依次进行重叠延伸PCR以获得含CD8α铰链区、CD28跨膜区-胞内区、CD137胞内区及CD3ζ基因的拼接基因序列，将得到的拼接基因进行纯化与PMD19-T simple载体进行连接，并将连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，经扩增后提取质粒进行基因测序，测序正确的质粒命名为CD8αHinge-CD28-CD137-CD3ζ-Tsimple，进行保存备用；五、在CD8α信号肽基因上游添加kozak序列以增加目的基因的表达量，同时在kozak序列前加入Nhe I酶切位点，在CD8α信号肽基因下游依次加入BamH I和EcoR I酶切位点，合成得到单链CD8αLeader DNA序列；六、用限制性内切酶Nhe I和Not I对pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro载体进行双酶切，1％琼脂糖凝胶回收线性载体；用限制性内切酶EcoR I和Not I对质粒CD8αHinge-CD28-CD137-CD3ζ-T simple进行双酶切，胶回收CD8αHinge-CD28-CD137-CD3ζ片段；将步骤五合成的单链CD8αLeader...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘春香，张怡，芦慧颖，石佳宁，刘艳青，
申请(专利权)人：黑龙江天晴干细胞股份有限公司，
类型：发明
国别省市：黑龙江;23