一种肠道病毒通用型、柯萨奇病毒A16型、肠道病毒71型核酸荧光PCR检测试剂盒制造技术

本发明专利技术实施例公开了一种肠道病毒通用型、柯萨奇病毒A16型、肠道病毒71型核酸荧光PCR检测试剂盒，包括RNA提取溶液、RNA洗脱液、内标、PCR反应液、EV/CA16/EV71酶混合液、EV/CA16/EV71阳性对照品、EV/CA16/EV71阴性对照品；本试剂盒在同一样本中同时检测肠道病毒通用型、柯萨奇病毒A16型、肠道病毒71型三种肠道病毒，而不能检测出其他病原体RNA并且检测灵敏度可达400copie/ml，检测范围为4.0E+02～4.0E+08copies/ml，为早期诊断肠道病毒通用型、柯萨奇病毒A16型和肠道病毒71型感染提供可靠的实验证据。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及核酸荧光PCR检测试剂盒，尤其涉及肠道病毒通用型、柯萨奇病毒A16型、肠道病毒71型核酸荧光PCR检测试剂盒，属于手足口病的体外诊断领域。
技术介绍
手足口病(Hand-foot-mouthdisease，HFMD)又名发疹性水疱口腔炎，是由一组肠道病毒引起的常见传染病，临床表现以发热和手、足、口腔等部位的皮疹为主要临床特征的一种急性传染病。绝大多数HFMD患者预后良好，一般可在5～7天痊愈，属于自限性疾病。病毒还可以侵犯呼吸系统、中枢神经系统等引起脑炎、肺水肿、弛缓性麻痹、心肌炎等症状，个别危重患儿可因多种原因导致死亡。该病全年均可发病，好发于夏秋季，常见于5岁以下的儿童。HFMD的主要传播途径是粪-口途径，亦可通过呼吸道传播。HFMD传染性强，易导致流行或暴发。HFMD分布极广泛，无严格地区性。HFMD全年均可发病，有明显的季节特点，以夏秋季多见。引起HFMD的主要为小核糖核酸病毒科(Picornaviridae)肠道病毒属的柯萨奇病毒(Coxsackievirus)A组的4型、5型、7型、9型、10型、16型；柯萨奇病毒B组的2型、5型；部分埃可病毒(ECHO-viruses)和肠道病毒71型。最常见为柯萨奇病毒A组16型(CoxA16)及肠道病毒71型(EV71)。人对引起HFMD的肠道病毒普遍易感，各年龄组均可感染发病，但以隐性感染为主，隐性感染与显性感染之比约为100:1。由于机体受病毒感染后，产生的中和抗体可在体内存留较长时间，对同型病毒感染产生牢固的免疫力，因此，HFMD的患者主要为学龄前儿童，尤其是5岁以下儿童，占发病数90％以上。而大多数成人可携带病毒但不发病。1岁以内的儿童发生心肌炎、脑炎等重症的比例较1岁以上儿童高。中国手足口病流行，1981年上海首次报道手足口病；1983年天津发生CoxA16引起的手足口病暴发；1995年武汉病毒研究所从手足口病人中分离出EV71；1998年中国台湾地区129106例HFMD，其中405例为严重的中枢神经系统感染，78例死亡；1999年以来，中国广东、福建、上海、重庆等地区报告局部流行EV71感染；2007年山东临沂流行以EV71为主的手足口病；2008～2009年安徽阜阳、河南、山东等地大规模流行。主要为CoxA16和EV71共循环引起手足口病发，EV71在大部分省市为优势病毒。实时荧光PCR技术(FQ-PCR)把PCR、分子杂交和光化学融为一体，使PCR扩增和产物分析的全过程均在单管封闭条件下进行。实时荧光PCR技术与其它检测技术相比具有以下优势：(1)与免疫学检测比较，具有更高的灵敏度，从理论上讲只要有一个基因拷贝就可以检测出来；(2)根据各种病原体独特的保守基因序列设计引物，能够保证PCR反应的高度特异性，避免交叉反应；(3)能对病毒进行定量检测，可反映出患者体内病原体拷贝数的高低和复制情况，定量检测有助于判断病原体感染与疾病发生和发展的关系，探讨药物对病原体的作用，了解感染性疾病病人用药后病情的变化情况，这对理解发病机制和预测抗病毒治疗的有效性十分关键；(4)可扩大检测人群的范围，适用于大规模的流行病调查，对手足口病这类自然感染率极高的病原微生物尤其适用；(5)将PCR敏感性与探针特异性相结合，在很大程度上改变了传统PCR的缺陷，缩短了反应时间，简化了操作步骤；(6)全过程均在单管封闭条件下进行，避免了由于样本间交叉引起的假阴性和环境污染；(7)实时检测技术可连续不断的检测PCR过程中荣耀信号的变化，避免了传统PCR的“平台期效应”，并且模板的定量不通过终产物，而由Ct值算出，准确性和灵敏性都有提高。国内已有多种基于实时荧光定量PCR技术定量检测EV、CA16、EV71RNA的试剂盒应用于临床检测中，这些试剂盒所提供的RNA提取方法主要是酚-氯仿法和柱提取法。该类试剂盒存在很多不足之处：(1)检测灵敏度低，约在1000copie/ml左右；检测范围窄，一般在1.00E+03copie/ml～1.00E+07copie/ml之间，对于临床高值(大于5.00E+07copie/ml)和低值(小于1.00E+03copie/ml)的样本无法检测；(2)对于CA16的不同亚型存在一定的漏检现象；(3)酚-氯仿法是最经典的RNA提取方法，但是操作繁琐，对于设备和人员操作要求高，低病毒载量的标本检出率低，且所用试剂具有一定的毒性；柱提取方法无需高速离心，但是需频繁更换离心管，用时长，特异性较差；(4)无法有效去除样本中的PCR抑制物(如：全血、痰液等)，体系中一般没有阳性内对照(即内标)，无法预防假阴性；(5)国外试剂成本和耗材成本太高，很难在临床广泛开展；(6)国内大部分试剂只能做单管检测，检测3个型需要用三管反应液。
技术实现思路
本专利技术的目的在于解决现有肠道病毒通用型(EV)、柯萨奇病毒A16型(CA16)、肠道病毒71型(EV71)荧光定量PCR检测试剂盒的缺陷，提供一种RNA提取得率高、检测灵敏度高、检测范围宽而准确的EV/CA16/EV71核酸荧光PCR检测试剂盒，可以对咽拭子等未知样本中的肠道病毒RNA进行快速、准确检测，并且可以区分CA16、EV71基因型，检测结果可用于EV/CA16/EV71感染的辅助诊断。本专利技术实施例中提供了一种肠道病毒通用型EV/柯萨奇病毒CA16型/肠道病毒EV71型核酸荧光PCR检测试剂盒，其包括以下各组分：RNA提取溶液、RNA洗脱液、内标、PCR反应液、EV/CA16/EV71酶混合液、EV/CA16/EV71阳性对照品、EV/CA16/EV71阴性对照品，其中，所述PCR反应液包括0.1μmol/L～0.5μmol/L用于靶多核苷酸扩增的上下游引物EV-F、CA16-F、EV71-F与EV-R、CA16-R、EV71-R以及用于靶多核苷酸检测的探针EV-P、CA16-P、EV71-P，所述用于靶多核苷酸扩增的上下游引物以及用于靶多核苷酸检测的探针，其碱基对序列分别为：EV上游引物EV-F：5′-GACATGGTGTGAAGAGCCTATTG-3′；EV下游引物EV-R：5′-CGGACACCCAAAGTAGTCGG-3′；EV探针EV-P：5′-CY5-CCCCTGAATGCGGCTAATCCTAAC-BHQ2-3’；CA16上游引物CA16-F：5′-TATGTTAATTGGGACATTGATTTGA-3′；CA16下游引物CA16-R：5′-ACCATTGGGTTTGGCTACG-3本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种肠道病毒通用型、柯萨奇病毒A16型、肠道病毒71型核酸荧光PCR检测试剂盒，其特征在于，包括以下各组分：RNA提取溶液、RNA洗脱液、内标、PCR反应液、EV/CA16/EV71酶混合液、EV/CA16/EV71阳性对照品、EV/CA16/EV71阴性对照品，其中，所述PCR反应液包括用于靶多核苷酸扩增的上下游引物EV‑F、CA16‑F、EV71‑F与EV‑R、CA16‑R、EV71‑R以及用于靶多核苷酸检测的探针EV‑P、CA16‑P、EV71‑P，所述用于靶多核苷酸扩增的上下游引物以及用于靶多核苷酸检测的探针，其碱基对序列分别为：EV上游引物EV‑F：5′‑GACATGGTGTGAAGAGCCTATTG‑3′；EV下游引物EV‑R：5′‑CGGACACCCAAAGTAGTCGG‑3′；EV探针EV‑P：5′‑CY5‑CCCCTGAATGCGGCTAATCCTAAC‑BHQ2‑3’；CA16上游引物CA16‑F：5′‑TATGTTAATTGGGACATTGATTTGA‑3′；CA16下游引物CA16‑R：5′‑ACCATTGGGTTTGGCTACG‑3′；CA16探针CA16‑P：5′‑FAM‑ATATGCTCAGCTGCGGCGG‑BHQ1‑3′；EV71上游引物EV71‑F：5′‑TCCCACATTCGGAGAACACA‑3′；EV71下游引物EV71‑R：5′‑AAGGGTACTTGGACTTGGAGGT‑3′；EV71探针EV71‑P：5′‑HEX‑AGGAGAAAGATCTTGAATACGGGGC‑BHQ1‑3′。...

【技术特征摘要】
1.一种肠道病毒通用型、柯萨奇病毒A16型、肠道病毒71型核酸荧光PCR检测试
剂盒，其特征在于，包括以下各组分：RNA提取溶液、RNA洗脱液、内标、PCR反应
液、EV/CA16/EV71酶混合液、EV/CA16/EV71阳性对照品、EV/CA16/EV71阴性对照品，
其中，所述PCR反应液包括用于靶多核苷酸扩增的上下游引物EV-F、CA16-F、EV71-F
与EV-R、CA16-R、EV71-R以及用于靶多核苷酸检测的探针EV-P、CA16-P、EV71-P，
所述用于靶多核苷酸扩增的上下游引物以及用于靶多核苷酸检测的探针，其碱基对序列
分别为：
EV上游引物EV-F：5′-GACATGGTGTGAAGAGCCTATTG-3′；
EV下游引物EV-R：5′-CGGACACCCAAAGTAGTCGG-3′；
EV探针EV-P：5′-CY5-CCCCTGAATGCGGCTAATCCTAAC-BHQ2-3’；
CA16上游引物CA16-F：5′-TATGTTAATTGGGACATTGATTTGA-3′；
CA16下游引物CA16-R：5′-ACCATTGGGTTTGGCTACG-3′；
CA16探针CA16-P：5′-FAM-ATATGCTCAGCTGCGGCGG-BHQ1-3′；
EV71上游引物EV71-F：5′-TCCCACATTCGGAGAACACA-3′；
EV71下游引物EV71-R：5′-AAGGGTACTTGGACTTGGAGGT-3′；
EV71探针EV71-P：5′-HEX-AGGAGAAAGATCTTGAATACGGGGC-BHQ1-3′。
2.根据权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于，所述内标为插入pUC18T载体
的长为90碱基对的人工合成DNA序列的重组体，其浓度为1.00E+03copies/ml～1.00E+06
copies/ml；90碱基对的序列如下所示：
5′-CAGCTTGTTGTAACAAAGCATCCGCTCCCCCATTCATGTTGCTGGGTACAGAC
AGTTACCTCTCCACTAGGCAAATCTCAACAGGATCAG-3′。
3.根据权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于，所述RNA提取溶液包括如下
组分：
RNA提取溶液I：十二烷基硫酸钠，质量/体积0.3％～1.2％、曲拉通，体积/体积
1.0％～5.0％，异硫氰酸胍0.1mol/L～1.2mol/L、50μg/ml～350μg/ml的磁珠；
RNA提取溶液II：4-羟乙基哌嗪乙磺酸150mmol/L～350mmol/L、pH6.5±0.2，氯化

\t钠150mmol/L～400mmol/L；
RNA提取溶液III：曲拉通，体积/体积0.5％～3.0％、氯化钠100mmol/L～400mmol/L；
RNA提取溶液IV：矿物油。
4.根据权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于，所述RNA洗脱液为Tris-HCl0.5
mol/L～1.5mol/L、EDTA0.2mol/L～1.5mol/L。.
5.根据权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于，所述PCR反应液还包括5×PCR
反应缓冲液10μl，2mmol/L脱氧核糖核苷三磷酸，0.1μmol/L～0.4μmol/L用于检测内标
的上下游引物IC-F与IC-R，0.1μmol/L～0.4μmol/L用于检测内标的探针IC-P。
6.根据权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于，所述用于检测内标的上下游引
物以及用于检测内标的探针，其碱基对序列分别为：
内标上游引物IC-F：5′-CAGCTTGTTGTAACAAAGCA-3′；
内标下游引物IC-R：5′-CTGATCCTGTTGAGATTTGCC-3′；
内标探针IC-P：5′ROX-CTC...

【专利技术属性】
技术研发人员：戴立忠，黄河，邓中平，易晓明，
申请(专利权)人：湖南圣湘生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：湖南;43