一种生产硫酸软骨素的方法技术

本发明专利技术提供了一种生产硫酸软骨素的方法，将芽孢杆菌以4‑6％接种量至种子培养基中，所述的芽孢杆菌的保藏编号CCTCC NO:M2016263，振荡培养得到种子液，将种子液以接种量为4‑6％接入发酵培养基中，在摇床上进行培养发酵得到含硫酸软骨素的发酵液；将得到的硫酸软骨素发酵液提纯后得到硫酸软骨素。本发明专利技术方法步骤简单，条件温和，产量较高，发酵生产原料不受动物骨原料短缺的限制，发酵产品可用于药品原料和保健品原料。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于微生物发酵领域，涉及一种硫酸软骨素，具体来说是一种生产硫酸软骨素发酵液方法。
技术介绍
硫酸软骨素 (Chondroitin Sulfate，CS) 是广泛分布于动物软骨组织中的一类酸性黏多糖。2010 年 Jolly 对许多微生物发酵进行分析，发现有多种微生物也能产生硫酸软骨素。例如巴斯德杆菌（P asteurella multocida ），大肠杆菌（ Escherichia coli），芽孢杆菌（Bacillus），等少数细菌中存在硫酸软骨素。硫酸软骨素分子结构为由 D- 葡萄糖醛酸和 N- 乙酰氨基半乳糖构成的重复二糖单位组成的多糖，硫酸软骨素一般含有50~70个二糖基本单位，相对分子质量在10 000~50 000之间。按酯化的硫酸基团位置不同，硫酸软骨素分为A、B、C、D、E、F等多种类型。临床上主要用于关节炎、肩关节痛、冠心病、心绞痛等辅助治疗，近年来，硫酸软骨素在医药制剂、医学材料、化妆品、保健品等领域更广泛得到应用，市场需求趋愈来愈大。我国生产和出口量逐年大幅增长，发展前景广阔。目前，我国主要采用酶解法或碱提-酶解法工艺从动物骨头制备硫酸软骨素。极少有采用微生物发酵法生产硫酸软骨素的报道。而动物骨资源比较贫乏，急待开发新的生物资源及新的技术工艺来生产硫酸软骨素。
技术实现思路
针对现有技术中的上述技术问题，本专利技术提供了一种生产硫酸软骨素的方法，所述的这种生产硫酸软骨素的方法要解决现有技术从动物骨头中生产硫酸软骨素的方法中，骨头原料短缺难以扩大生产规模的技术问题。本专利技术提供了一种生产硫酸软骨素的方法，包括如下步骤：1)将芽孢杆菌以接种量为 4-6％接种至种子培养基上进行震荡培养15-18h，得到种子培养液，所述的芽孢杆菌的保藏编号CCTCC NO:M2016263，种子培养条件为：转速120-160r/m，初始pH 值为 7.0-7.2，发酵温度为28-35℃；2)将步骤1)得到种子液以接种量为 4-6％接种到装有发酵培养基的容器中，在摇床上培养30-35h；即可得到含硫酸软骨素发酵液，培养条件为：转速120-160r/m，初始pH 值为 7.0-7.2，温度为30-35℃；3)将得到的硫酸软骨素发酵液提纯后得到硫酸软骨素。进一步的，所述种子培养基由蔗糖、蛋白胨、酵母粉、氯化钠、硫酸镁、磷酸二氢钾、氯化钙、硫酸锰和水组成，每L培养基中，含有蔗糖15-20g，蛋白胨15-20g，酵母粉15-20g，氯化钠0.5-1.0g，硫酸镁0.5-1.0g，磷酸二氢钾1.5-2.5g，所述的氯化钙0.2-0.5g，硫酸锰0.1-1.0g，余量为水。进一步的，所述发酵培养基由蔗糖、蛋白胨、酵母粉、氯化钠、硫酸镁、磷酸二氢钾、氯化钙、硫酸锰和水组成，所述缓冲液由磷酸氢二钠，磷酸二氢钠组成；每L培养基中，含有蔗糖20-50g，蛋白胨10-15g，酵母粉10-15g，氯化钠0.5-2.0g，硫酸镁1.5-2.5g，磷酸二氢钾1.5-2.5g，氯化钙0.2-0.5g，硫酸锰0.1-1.0g，磷酸氢二钠1.0－4.0 g，磷酸二氢钠0.3－3.0g，余量为水。具体的，采用乙醇沉淀法进行纯化处理得到硫酸软骨素。本专利技术的一种芽孢杆菌，其分类命名为芽孢杆菌G-09 Bacillussp.G-09，该菌株保藏于中国典型培养物保藏中心（CCTCC）中，中国典型培养物保藏中心的地址为：中国、武汉、武汉大学，保藏日期为2016年5月16号，保藏号为CCTCC NO：M201623。通过本专利技术方法获得的硫酸软骨素多糖的产量约127mg/L。本专利技术和已有技术相比，其技术进步是显著的。本专利技术的方法步骤简单，条件温和，产量较高，发酵生产原料不受动物骨原料短缺的限制，发酵产品可用于药品原料和保健品原料。具体实施方式实施例1：芽孢杆菌的筛选方法。芽孢杆菌分离纯化：从采集于郊外枯枝烂叶的土壤中，称取3-5g土样，风干后，放入30-50ml灭菌蒸馏水（玻璃珠5粒）的三角瓶中，摇瓶30-60min，然后放在85℃水浴30min，冷却后，稀释至10-3，10-4，10-5稀释液，分别取稀释液0.1-0.2ml涂布于牛肉膏蛋白胨平板，置于35℃，倒置培养32-48h，观察菌落的形态特征。并调取单菌落，用孔雀绿染色法染色进一步镜检观察。孔雀绿染色法步骤如下：(1)挑菌落按革兰氏染色法涂片后，用6%孔雀绿水溶液染10min。(2)用自来水冲洗。(3)用0.5%番红液复染2min，水洗，吸干。于显微镜下观察，芽孢呈绿色，菌体呈红色。挑出产芽孢的菌落编号保存，作为进一步筛选的菌种。产硫酸软骨素芽孢杆菌的筛选：将上述分离纯化得到的菌种接种于LB肉汤培养基（蛋白胨10g，牛肉膏15g，NaCl15g，蒸馏水1000ml，调节PH7.2）培养24h-48h后离心收集发酵液，发酵液采用高效液相色谱法分析，选出发酵液中产酸软骨素较高菌株，即为产硫酸软骨素的芽孢杆菌。将该菌株保藏于中国典型培养物保藏中心（CCTCC）中，其保藏号为CCTCCNo：M201623。将筛选得到的产硫酸软骨素的芽孢杆菌经形态学、生理生化鉴定为芽孢杆菌，并命名为Bacillus.sp G-09。实施例2： Bacillus.sp G-09菌株的鉴定（1）形态特征观察将G-09菌株接种于LB固体培养基中，在35℃恒温条件下培养48h，形成菌落，菌落特征为乳白色不透明、湿润、粘稠；显微镜观察菌体呈杆状，末端圆，单个或呈短链状排列。菌体有芽孢形成，芽胞直径大于1.0μm，革兰氏染色呈紫色，为革兰氏阳性杆菌。(2)生理生化鉴定参考RE .希坎南.《 伯杰氏细菌鉴定手册》（北京: 科学出版社, 1989 ）的方法，对G-09菌株进行生理生化特性鉴定，鉴定结果是VP试验阳性，MR试验阳性，接触酶实验阳性，明胶液化阳性，吲哚试验阳性，柠檬酸盐实验阳性，淀粉水解实验阳性，耐盐实验阳性。(3) 16S rDNA 分子生物学鉴定16S rDNA 的扩增:扩增引物：P1：5-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3 ，P2 :5-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3 。PCR反应体系：0.20μl Taq DNA 聚合酶；2.5μl 10×PCR反应缓冲液；1μl dNTP （各2.5mM）；0.5μl P1(10 uM)；0.5μl P2(10 uM)；0.5μl基因组DNA（ 20-50ng/μl），加双蒸H2O 至25μl。PCR反应条件：94℃ 5 min；94℃ 30 S，55℃ 40 S，72℃ 90 s，30个循环；72℃终延伸10 min。PCR 产物检测及16S rDNA序列的测定：PCR 产物经过1％琼脂糖电泳（150V、100mA 20min）后，将PCR扩增产物进行测序，然后将得到的16 S rDNA序列提交到NCBI核酸数据库中进行BLAST在线分析。所得16S rDNA 序列与GenBank 数据库中核苷酸序列进行同源性分析，得到与之亲缘关系最近的菌种Bacillus sp 0711P6-2;HM226670，同源性达99％。根据菌落的形态，生理生化特性，根据形态特征、生理生化特征和16S rDNA 序列分析，鉴定G-09菌株为芽孢杆菌（Bac本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种生产硫酸软骨素的方法，其特征在于包括如下步骤：1）将芽孢杆菌以接种量为 4‑6％接种至种子培养基上进行震荡培养15‑18h，得到种子培养液，所述的芽孢杆菌的保藏编号CCTCC NO:M2016263，种子培养条件为：转速120‑160r/m，初始pH 值为 7.0‑7.2，发酵温度为28‑35℃；2）将步骤1)得到种子液以接种量为 4‑6％接种到装有发酵培养基的容器中，在摇床上培养30‑35h；即可得到含硫酸软骨素发酵液，培养条件为：转速120‑160r/m，初始pH 值为 7.0‑7.2，温度为30‑35℃；3）将得到的硫酸软骨素发酵液提纯后得到硫酸软骨素。

【技术特征摘要】
1.一种生产硫酸软骨素的方法，其特征在于包括如下步骤：1）将芽孢杆菌以接种量为 4-6％接种至种子培养基上进行震荡培养15-18h，得到种子培养液，所述的芽孢杆菌的保藏编号CCTCC NO:M2016263，种子培养条件为：转速120-160r/m，初始pH 值为 7.0-7.2，发酵温度为28-35℃；2）将步骤1)得到种子液以接种量为 4-6％接种到装有发酵培养基的容器中，在摇床上培养30-35h；即可得到含硫酸软骨素发酵液，培养条件为：转速120-160r/m，初始pH 值为 7.0-7.2，温度为30-35℃；3）将得到的硫酸软骨素发酵液提纯后得到硫酸软骨素。2.根据权利要求1所述的一种生产硫酸软骨素的方法，其特征在于：所述种子培养基由蔗糖、蛋白胨、酵母粉、氯化钠、硫酸镁、磷酸二氢...

【专利技术属性】
技术研发人员：龚钢明，赵芳芳，
申请(专利权)人：上海应用技术学院，
类型：发明
国别省市：上海;31