从鲟鱼鱼骨中提取硫酸软骨素的方法、由该方法提取的硫酸软骨素及应用技术

本发明专利技术涉及硫酸软骨素提取方法，特别涉及一种稀碱‑酶解法提取鲟鱼中硫酸软骨素的方法，首先采用碱液提取之后盐析去除蛋白质的方法提取，具体的是在鲟鱼的干燥软骨中加入浓度为3％NaOH溶液，料液比1:6(g/ml)，在35℃下提取2h，之后取上清，加入3％(g/ml)的NaCl，90℃静置20min，过滤。之后用胰酶进行酶解。本发明专利技术的提取方法较大幅度地提高了产品中有效成分氨基己糖的含量。另外，硫酸软骨素(CS)是通过低聚糖苷与蛋白质分子的丝氨酸残基相连，因此在稀碱－酶解法中，由于酶水解的肽链有一定特异性，释放出的硫酸软骨素可能仍连着多个氨基酸残基或多肽。本发明专利技术提取方法中还增加了升温盐析一步，降低蛋白酶的用量，生产成本降低，从而使产品的含氮量偏高的问题得到了一定程度上的解决。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及硫酸软骨素提取方法，特别涉及一种从鲟鱼鱼骨中提取硫酸软骨素的方法、由该方法提取的硫酸软骨素及应用。
技术介绍
硫酸软骨素(Chondroitinsulfate，简称CS)，是一种酸性粘多糖，属糖胺聚糖类物质，一般呈白色或微黄色的粉末，略带碱味。根据分子结构中糖醛酸种类和氨基已糖上硫酸酯的位置不同，硫酸软骨素有CS—A、B、C、D、E等多种异构体。目前，CS在临床上主要用于治疗某些神经头疼、神经痛、偏头痛、动脉粥样硬化、风湿、类风湿、链霉素引起的听觉障碍以及辅助治疗肝炎和肿瘤等。此外，CS还是保健品、化妆品、药物制剂的重要原料。近年来，CS的研究已逐渐受到人们的重视。目前，我国生产软骨素的原料主要是传统的软骨资源(如牛、羊、马、猪、鸡、鸭等的软骨)，但是目前用家禽家畜加工成医药原料的CS，其产品外观不能令人满意，而且生产工序长、提取率低、原材料浪费严重、与国外同类产品质量有较大差别等许多问题。近年，国外已开始从软骨鱼─鲨鱼中提取硫酸软骨素的研究，其成品色泽较好，产品较为稳定等受到人们的普遍欢迎。由于鲨鱼是海洋中最凶猛的肉食性软骨鱼，可养殖性不高且资源有限，有些种类几乎濒临灭绝，这大大限制了鲨鱼硫酸软骨素的开发。因此，开发新的CS原料资源具有重要的实际意义。鲟鱼，与鲨鱼同属软骨鱼纲，软骨组织含量丰富。其中，史氏鲟、杂交鲟以及西伯利亚鲟等均可进行人工养殖，资源丰富。近年来，我国各地鲟鱼养殖规模不断扩大，产量逐年猛增，据不完全统计，目前鲟鱼全国年产量已达数万吨，且持证养殖的鲟鱼可作为食品销售。针对不同原料来源，硫酸软骨素的提取工艺较为多样。但总的来说，其工艺包括：“碱提”→“除蛋白”→“乙醇沉淀”→“粗品”。根据“碱提”所用的碱浓度不同，又可分为浓碱、中碱和稀碱三种提取工艺。综合比较国内外的文献得知，采用浓碱和中碱提取工艺，虽然其提取速度较快，但是硫酸软骨素的品质较差、色泽黄或浅红、易变质，且提取过程中药品消耗量大，污染严重。
技术实现思路
本专利技术针对现有技术的不足，提供从鲟鱼鱼骨中提取硫酸软骨素的方法、由该方法提取的硫酸软骨素及应用。本专利技术技术方案如下：一种从鲟鱼鱼骨中粗提取硫酸软骨素的方法，采用碱液提取之后盐析去除蛋白质的方法提取，具体的是在鲟鱼的干燥软骨中加入浓度为3％NaOH溶液，料液比1:6(g/ml)，在35℃下提取2h，之后取上清，加入3％(g/ml)的NaCl，90℃静置20min，过滤。在上述方案的基础上，所述的鲟鱼的干燥软骨是由以下方法制得：除去鲟鱼软骨上残留的肌肉、脂肪和其它结缔组织，切碎，加入5倍体积的丙酮浸泡两次，每次1h；回收丙酮后，再加入5倍体积的乙醚浸泡1h后，回收乙醚，自然晾干。在上述方案的基础上，除去鲟鱼软骨上残留的肌肉、脂肪和其它结缔组织的方法是加热煮沸10min。一种从鲟鱼鱼骨中提取硫酸软骨素的方法，具体步骤如下：1)预处理、脱脂：除去软骨上残留的肌肉、脂肪和其它结缔组织，切碎，加入5倍体积的丙酮浸泡两次，每次1h；回收丙酮后，再加入5倍体积的乙醚浸泡1h后，回收乙醚，自然晾干鲟鱼软骨；2)提取：在鲟鱼的干燥软骨中加入浓度为3％NaOH溶液，料液比1:6(g/ml)，在35℃下提取2h；3)取上清，加入3％(g/ml)的NaCl，90℃静置20min，过滤；4)酶解：用10％的NaOH调上清液pH至8.9，加入液体体积0.05％-0.06％的胰酶，在50-55℃下酶解，在酶解过程中，随时调pH至8.9；酶解完成后，将温度升至85℃，恒温水浴30min；5)吸附：调水解液pH至6.8，加入体积1％的滑石粉，搅拌吸附1h，再用盐酸调pH至6.4，4600rpm离心20min，取上清；6)沉淀、干燥：调pH至6.0，加入无水乙醇使乙醇体积分数达60％，搅拌，使细粒聚集成大颗粒沉淀，静置12h以上。收集沉淀，于60℃的干燥箱中干燥。在上述方案的基础上，步骤1)中除去软骨上残留的肌肉、脂肪和其它结缔组织的方法是加热煮沸10min。在上述方案的基础上，步骤4)中的干燥条件为：60℃恒温真空干燥2小时、常温真空干燥24小时或真空冷冻干燥。本专利技术的有益效果是：本专利技术的提取方法较大幅度地提高了产品中有效成分氨基己糖的含量。另外，硫酸软骨素(CS)是通过低聚糖苷与蛋白质分子的丝氨酸残基相连，因此在稀碱－酶解法中，由于酶水解的肽链有一定特异性，释放出的硫酸软骨素可能仍连着多个氨基酸残基或多肽。本专利技术提取方法中还增加了升温盐析一步，降低蛋白酶的用量，生产成本降低，从而使产品的含氮量偏高的问题得到了一定程度上的解决。附图说明：图1为鲟鱼CS对小鼠胸腺肥大细胞数量的影响；图2为CS对小鼠肝癌H227402肿瘤细胞体外培养生长的影响；图3为CS对小鼠肝癌H227721肿瘤细胞体外培养生长的影响；图4为CS对小鼠肝癌H22HepG2肿瘤细胞体外培养生长的影响；图5为预防性灌胃CS给药对小鼠肝癌H22肿瘤细胞接种后肿瘤体积的影响；图6为预防性灌胃给药CS对小鼠肝癌H22肿瘤细胞接种后小鼠重量的影响；图7为预防性灌胃给药CS对小鼠肝癌H22肿瘤细胞接种后肿瘤重量的影响；图8为预防性灌胃给药CS对小鼠肝癌H22肿瘤细胞接种后抑瘤率的影响；图9为鲟鱼CS对小鼠肝癌H22肿瘤细胞接种后肿瘤体积的影响；图10为鲟鱼CS对小鼠肝癌H22肿瘤细胞接种后小鼠重量的影响；图11为鲟鱼CS对小鼠肝癌H22肿瘤细胞接种后肿瘤重量的影响；图12为鲟鱼CS对小鼠肝癌H22肿瘤细胞接种后的抑瘤率；图13为酶解过程中溶液pH的变化。具体实施方式本专利技术的具体实施方式如下：现有技术中硫酸软骨素的提取方法为：1)预处理：除去软骨上残留的肌肉、脂肪和其它结缔组织，切碎。2)脱脂：加入其体积5倍的丙酮，共2次，每次浸泡1h，回收丙酮后，再用其体积5倍的乙醚浸泡1h，回收乙醚，将鲟鱼软骨放在通风处自然干燥。3)提取：取洁白干燥鲟鱼软骨，加入6倍体积2％的NaOH，室温静置6-8h。4)盐解：加入相当于上清液总体积量2％的NaCl静置6-8h。过滤。5)酶解：用10％的NaOH调上清液pH至8.9，加入液体体积0.03％的胰酶，在水解过程中，随时调pH至8.9；水解2.5h后，用三氯乙酸检查已至终点，将温度升至85℃，恒温水浴30min。6)吸附：调水解液pH至6.8，加入体积1％的滑石粉，搅拌吸附1h，再用盐酸调pH至6.4，4600rpm离心20min，取上清。7)沉淀、干燥：调pH至6.0，加入无水乙醇使乙醇体积分数达60％，搅拌，使细粒聚集成大颗粒沉淀，静置12h以上。收集沉淀，于60℃的干燥箱中干燥。使用上述方法提取鲟鱼和鲨鱼鱼骨中的硫酸软骨素，并对提取产品进行检测，测定原理均是基于其组成的糖单位(D－葡萄糖醛酸和N－乙酰—D－氨基半乳糖)，硫酸基以及酸性粘多糖的大分子性质。本实验采用最为常用的比色法和凯氏定氮法。1、氨基己糖含量的检测氨基己糖的测定用比色法，又称Elson-Morgan法，测定原理是基于硫酸软骨素由D-葡萄糖醛酸和N-乙酰-D氨基半乳糖组成，经盐酸水解可释放出氨基己糖，在碱性条件下与乙酰丙酮缩合，产物与对二甲氨基苯甲醛的酸醇溶液呈红色，于波长525nm处测定吸光度，以氨基葡萄糖做对照品，计本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种从鲟鱼鱼骨中粗提取硫酸软骨素的方法，其特征在于，采用碱液提取之后盐析去除蛋白质的方法提取，具体的是在鲟鱼的干燥软骨中加入浓度为3％NaOH溶液，料液比1:6(g/ml)，在35℃下提取2h，之后取上清，加入3％(g/ml)的NaCl，90℃静置20min，过滤。

【技术特征摘要】
1.一种从鲟鱼鱼骨中粗提取硫酸软骨素的方法，其特征在于，采用碱液提取之后盐析去除蛋白质的方法提取，具体的是在鲟鱼的干燥软骨中加入浓度为3％NaOH溶液，料液比1:6(g/ml)，在35℃下提取2h，之后取上清，加入3％(g/ml)的NaCl，90℃静置20min，过滤。2.根据权利要求1所述的从鲟鱼鱼骨中粗提取硫酸软骨素的方法，其特征在于，所述的鲟鱼的干燥软骨是由以下方法制得：除去鲟鱼软骨上残留的肌肉、脂肪和其它结缔组织，切碎，加入5倍体积的丙酮浸泡两次，每次1h；回收丙酮后，再加入5倍体积的乙醚浸泡1h后，回收乙醚，自然晾干。3.根据权利要求2所述的从鲟鱼鱼骨中粗提取硫酸软骨素的方法，其特征在于，除去鲟鱼软骨上残留的肌肉、脂肪和其它结缔组织的方法是加热煮沸10min。4.一种从鲟鱼鱼骨中提取硫酸软骨素的方法，其特征在于，具体步骤如下：1)预处理、脱脂：除去软骨上残留的肌肉、脂肪和其它结缔组织，切碎，加入5倍体积的丙酮浸泡两次，每次1h；回收丙酮后，再加入5倍体积的乙醚浸泡1h后，回收乙醚，自然晾干鲟鱼软骨；2)提取：在鲟鱼的干燥软骨中加入浓度为3％NaOH溶液，料液比1:6(g/ml)，在35℃下提取2h；3)取上清...

【专利技术属性】
技术研发人员：黄世玉，关瑞章，
申请(专利权)人：集美大学，
类型：发明
国别省市：福建;35