CRISPR技术编辑并用IGF优化的异体间充质干细胞的制备方法及在治疗心梗中应用技术

本发明专利技术属于异体间充质干细胞应用领域，具体涉及CRISPR技术编辑并用IGF优化的异体间充质干细胞的制备方法及在治疗心梗中应用，包括如下步骤：利用密度梯度离心法分离获得异体的单个核细胞，然后通过贴壁培养获得间充质干细胞；设计间充质干细胞表面抗原B2M‑gRNA，炎症因子TNF‑α‑gRNA；构建重组的慢病毒颗粒并转染间充质干细胞；用IGF‑1优化间充质干细胞；利用改造和优化后的间充质干细胞来制备治疗心肌梗死的药物。本发明专利技术利用CRISPR/Cas9技术清除异体间充质干细胞表面导致免疫排斥的抗原以及引起炎症反应的炎症因子，并用IGF‑1提高间充质干细胞的抗凋亡能力、促进其归巢，为临床治疗心血管疾病的药物的制备提供一套新的技术方案，所制备的异体间充质干细胞移植后不会引起免疫排斥。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于异体间充质干细胞应用领域，具体涉及CRISPR/Cas9技术编辑并利用生长因子优化的异体间充质干细胞的制备方法及在治疗心肌梗死中的应用。
技术介绍
随着社会经济的发展，国民生活方式发生了深刻的变化，尤其是人口老龄化及城镇化进程的加速，中国心血管病危险因素呈明显上升趋势，导致了心血管病的发病人数持续增加，其中急性心肌梗死(acute myocardial infarction,AMI)的死亡率亦呈上升趋势。急性心肌梗死是临床常见的急症之一，死亡率高，而且预后差，对人们的健康造成了严重危害。同时，AMI的发病率在世界范围内也是逐年上升。尽管近年来在介入治疗、心脏移植方面取得了可喜的进展，但是由于受到供体来源短缺、手术技能要求高等因素的限制，传统治疗方法在临床的应用也受到了限制。干细胞移植治疗是近年发展起来的一项新型临床前沿技术，其原理是通过移植或动员干细胞进入梗死心肌组织，增加梗死区心肌样细胞数量及毛细血管数量，逆转心脏重构，替代、修复或加强受损的组织或器官的生物学功能，改善心功能。根据国内外临床导向，基于我们基础研究的结果和临床数据,及从临床安全性、可行性考虑，我们从诱导型干细胞、心肌干细胞、血液中祖细胞等不同类型细胞中，首先选择了间充质干细胞(MSCs)。间充质干细胞是近年来兴起并得到快速发展的移植细胞，而且干细胞移植是国内外临床治疗心肌梗死的发展趋势。和其它类型的细胞相比，MSCs具有许多优点：(1)易于分离培养，疗效好，无伦理道德问题；(2)具有向心肌细胞分化的潜能；(3)免疫排斥性相对较低，有异体移植的前景；(4)独特的归巢功能，可以静脉系统输注。急性心肌梗死发生后的前48小时主要是心肌细胞的坏死，并伴有炎性细胞的侵润，不适宜进行细胞 移植。在第3-4天由于炎症因子还处于较高的水平也不适宜进行细胞移植。第7天时VEGF等生长分子的浓度达到峰值。2周后疤痕组织形成，细胞移植治疗难以生效。因此心梗后细胞移植的最佳时间是在第7-14天。但是考虑到心肌梗死一般发病都比较急，患者可能来不及准备自身的MSCs，而且心肌梗死大部分发生在老年人身上。研究显示随着年龄的增长，体内MSCs的数量随之减少，细胞活力也逐渐降低。因此，为了保证临床上能够及时有效的治疗心肌梗死，移植异体来源的间充质干细胞是理想的选择。尽管间充质干细胞的免疫排斥性相对较低，但是心肌梗死病灶部位的特殊微环境提高机体对移植后的间充质干细胞的敏感性，加重免疫排斥反应。为了进一步降低移植细胞和宿主之间的免疫排斥反应，提高细胞移植的治疗效果，本专利技术中利用CRISPR/Cas9这一精准的医学前沿技术对移植细胞进行编辑，清除异体MSCs细胞表面导致免疫排斥的抗原后，再进行异体移植治疗心肌梗死。CRISPR/Cas9技术是2013年张峰等团队基于某些细菌内存在的一种抵御外来病毒、质粒等遗传元件入侵的特异性免疫保护机制，专利技术的一种新型的基因编辑技术。由于其成本低、制作简便、快捷、高效等优点，迅速风靡于世界各地的实验室，成为科研、医疗等领域的有效技术。目前的研究显示CRISPR/Cas9技术已经在斑马鱼、大、小鼠、食蟹猴等不同的物种中成功的应用。尤其在临床应用方面有着很好的应用前景，美国哥伦比亚大学和爱荷华大学的科学家通过应用CRISPR/Cas9基因编辑技术诱导疾病患者多能干细胞分化的方式实现了眼疾色素性视网膜炎相关缺陷基因的修复。最近国内研究人员将病人的皮肤细胞诱导成iPS细胞(诱导多能干细胞)后，利用CRISPR/Cas9技术介导同源重组来修复发生突变的血红蛋白基因，再将修复的iPS细胞定向诱导分化为造血干细胞移植到病人体内，治疗人类的镰刀形贫血症。此外，像使用CRISPR/Cas9技术根除HIV病毒、诱导宫颈癌细胞自我毁灭、构建癌症模型等最新成果也已先后发表在Nature等著名杂志。但用CRISPR/Cas9技术清除间充质干细胞上免疫抗原，治疗心肌梗死，尚无相关报道。目前用的自体MSCs移植治疗心肌梗死是近年来兴起并得到快速发展的一项技术，还存在以下缺陷：1)心肌梗死一般发病都比较急，患者可能来不及准备自身的MSCs，而且心肌梗死大部分发生在老年人身上。研究显示随着年 龄的增长，体内MSCs的数量随之减少，细胞活力也逐渐降低，所以需要新的细胞移植技术，如本专利技术：无免疫排斥性的、抗凋亡、易归巢的异体MSCs；2)相对于本专利技术采用的CRISPR/Cas9技术，传统的siRNA技术具有转染效率相对较低，不能彻底的对靶基因进行敲除的缺陷。
技术实现思路
为了克服上述缺陷，本专利技术利用CRISPR/Cas9技术清除异体间充质干细胞表面导致免疫排斥的抗原以及引起炎症反应的炎症因子，并用IGF-1提高间充质干细胞的抗凋亡能力、促进其归巢，提供了一种CRISPR/Cas9技术编辑并利用生长因子优化的异体间充质干细胞的制备方法及在治疗心肌梗死中的应用。本专利技术克服了现有临床治疗心肌梗死手段的不足，为临床治疗心血管疾病提供一套全新的治疗方案。为了实现上述专利技术目的，本专利技术所采用的一个技术方案为：CRISPR/Cas9技术编辑并利用生长因子优化的异体间充质干细胞的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)利用密度梯度离心法分离获得异体的单个核细胞，通过贴壁培养获得异体间充质干细胞；(2)分别设计转录间充质干细胞表面抗原B2M、炎症因子TNF-α引导RNA(gRNA)对应的DNA序列：B2M-gRNA相应的DNA oligo序列为5’-AGTCACATGGTTCACACGGCAGG-3’；TNF-α-gRNA对应的DNA oligo序列为5’-TATCTCGACTTTGCCGAGTCTGG-3’(3)将B2M-gRNA相应的DNA oligo序列磷酸化聚合在一起形成双链后导入到载体中构建重组质粒并转染293T细胞以获得B2M重组慢病毒颗粒；将TNF-α-gRNA相应的DNA oligo序列磷酸化聚合在一起形成双链后导入到载体中构建重组质粒并转染293T细胞以获得TNF-α重组慢病毒颗粒，使得B2M重组慢病毒颗粒和TNF-α重组慢病毒颗粒同时侵染异体间充质干细胞；筛选阳性细胞并扩增培养；(4)用含有浓度为10～30ng/ml IGF-1分子的无血清人间充质干细胞(hMSC)培养基在低氧条件(O2浓度2％-5％)下培养异体间充质干细胞48小时。步骤(1)的具体过程为：a.无菌条件下采集顺产或剖腹产胎儿的脐带血，肝素抗凝；b.采集脐带血后立即分离，用PBS将脐带血按照1:1的体积比例进行稀释；c.将稀释后的血液缓慢加到等体积的淋巴细胞分离液上，加时要缓慢，注意不要冲破液体之间的分层，1000r/min离心15min；d.小心吸取中间界面的白膜层，PBS洗两遍后，用hMSC培养基悬浮细胞制成单细胞悬液,以5×106/mL密度接种，置于37℃的CO2培养箱中进行培养；e.7天后换液去除未贴壁细胞，2周后待贴壁细胞融合率达到90％时进行传代。在步骤(1)中，还包括对通过贴壁培养获得的异体间充质干细胞的鉴定步骤。步骤(3)的具体过程为：a.合成B2M-gRNA相应的双股DNA序列和TNF-α-gRNA相应的双股DNA序列；b.以LentiCRI本文档来自技高网...

【技术保护点】
CRISPR/Cas9技术编辑并利用生长因子优化的异体间充质干细胞的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)利用密度梯度离心法分离获得异体的单个核细胞，通过贴壁培养获得异体间充质干细胞；(2)分别设计转录间充质干细胞表面抗原B2M、炎症因子TNF‑α引导RNA(gRNA)对应的DNA序列：B2M‑gRNA对应DNA oligo序列为5’‑AGTCACATGGTTCACACGGC AGG‑3’； TNF‑α‑gRNA对应的DNA oligo序列为5’‑TATCTCGACTT TGCCGAGTCTGG‑3’(3)将B2M‑gRNA对应的DNA oligo序列磷酸化聚合在一起形成双链后导入到载体中构建重组质粒并转染293T细胞以获得B2M重组慢病毒颗粒；将TNF‑α‑gRNA对应的DNA oligo序列导入到载体中构建重组质粒并转染293T细胞以获得TNF‑α重组慢病毒颗粒，将得到的B2M重组慢病毒颗粒和TNF‑α重组慢病毒颗粒同时侵染异体间充质干细胞；筛选阳性细胞并扩增培养； (4)用含有浓度为10~30ng/ml IGF‑1分子的无血清人间充质干细胞（hMSC）培养基低氧条件下培养异体间充质干细胞48小时，低氧条件指O2浓度2%‑5%。...

【技术特征摘要】
1.CRISPR/Cas9技术编辑并利用生长因子优化的异体间充质干细胞的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)利用密度梯度离心法分离获得异体的单个核细胞，通过贴壁培养获得异体间充质干细胞；(2)分别设计转录间充质干细胞表面抗原B2M、炎症因子TNF-α引导RNA(gRNA)对应的DNA序列：B2M-gRNA对应DNA oligo序列为5’-AGTCACATGGTTCACACGGC AGG-3’； TNF-α-gRNA对应的DNA oligo序列为5’-TATCTCGACTT TGCCGAGTCTGG-3’(3)将B2M-gRNA对应的DNA oligo序列磷酸化聚合在一起形成双链后导入到载体中构建重组质粒并转染293T细胞以获得B2M重组慢病毒颗粒；将TNF-α-gRNA对应的DNA oligo序列导入到载体中构建重组质粒并转染293T细胞以获得TNF-α重组慢病毒颗粒，将得到的B2M重组慢病毒颗粒和TNF-α重组慢病毒颗粒同时侵染异体间充质干细胞；筛选阳性细胞并扩增培养； (4)用含有浓度为10~30ng/ml IGF-1分子的无血清人间充质干细胞（hMSC）培养基低氧条件下培养异体间充质干细胞48小时，低氧条件指O2浓度2%-5%。2.根据权利要求1所述的CRISPR/Cas9技术编辑并利用生长因子优化的异体间充质干细胞的制备方法，其特征在于，步骤（1）的具体过程为：a．无菌条件下采集顺产或剖腹产胎儿的脐带血，肝素抗凝；b．采集脐带血后立即分离，用PBS将脐带血按照1:1的体积比例进行稀释；c．将稀释后的血液缓慢加到等体积的淋巴细胞分离液中，1000r/min离心15min；d．小心吸取中间界面的白膜层，PBS洗两遍后，用hMSC培养基悬浮细胞制成单细胞悬液, 以5×106/ mL密度接种，置于37 ℃的CO2培养箱中进行培养；e．7天后换液去除未贴壁细胞，2周后待贴壁细胞融合率达到90%时进行传代。3.根据权利要求1所述的CRISPR/Cas9技术编辑并利用生长因子优化的异体间充质干细胞的制备方法，其特征在于，在步骤（1）中，还包括对通过贴壁培养获得的异体间充质干细胞的鉴定步骤。4. 根据权利要求1所述的CRISPR/Cas9技术编辑并利用生长因子优化的异体...

【专利技术属性】
技术研发人员：李杨欣，沈振亚，邵联波，
申请(专利权)人：苏州大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32