新型shRNA表达载体及其制备和应用制造技术

本发明专利技术公开了高效引发RNAi的新型核酶增强型shRNA及其制备方法和应用。所述核酶增强型shRNA从5′端到3′端依次为：(a)5′端配对区域；(b)顶端环区域；(c)3′端配对区域，并且所述5′端配对区域与3′端配对区域形成双链区域，所述双链区域长度大于或等于19bp；(d)3′端未配对区域；(e)与3′端未配对区域相连的核酶区，所述核酶增强型shRNA可产生siRNA，且所述siRNA的核苷酸序列对应于所述3′端或5′端配对区域。本发明专利技术核酶增强型shRNA加工生成siRNA的效率显著提高，对靶基因的抑制效率更高。

Novel shRNA expression vector, preparation and application thereof

The invention discloses a novel ribozyme enhancement type shRNA which efficiently raises RNAi and a preparation method and an application thereof. The ribozyme enhanced shRNA from the 5 'end to 3' end is as follows: (a) 5 'end pairing region; (b) the top ring region; (c) the 3' end of the pairing region, and the 5 'end and 3' end pairing region pairing region to form a double stranded region, the length of the the double stranded region is greater than or equal to 19bp; (d) the 3 'end of the unpaired region; (E) and the 3' end of the unpaired region linked ribozyme, the ribozyme enhanced shRNA can produce siRNA, and the nucleotide sequence corresponding to the siRNA in the 3 'or 5' end pairing region. The efficiency of the ribozyme enhanced shRNA processing and the generation of siRNA is remarkably improved, and the inhibition efficiency of the target gene is higher.

【技术实现步骤摘要】
新型shRNA表达载体及其制备和应用
本专利技术涉及生物
具体地说，本专利技术涉及新型的shRNA表达载体及其制备和应用。
技术介绍
RNA干扰(RNAinterference,RNAi)是真核生物中由双链小RNA分子(smallinterferingRNA，siRNA)介导的RNA降解现象，最初在秀丽线虫中被发现，此后发现RNAi现象在果蝇、拟南芥、斑马鱼和哺乳动物等多种真核生物中都是高度保守的。由于RNAi可以被用来特异性关闭靶基因的表达，具有极大的应用价值。因此，自1998年被发现以来，RNAi多次入选Science杂志评出的年度十大科学进展，并名列2002年十大科学进展之首。2006年，CraigMello和AndrewFire因发现RNAi现象而被授予诺贝尔生理医学奖。目前大量生物技术公司和国际大制药企业投资进入RNAi技术开发和应用领域，其中针对呼吸道合胞体病毒感染(Respiratorysyncytialvirusinfection)以及湿性年龄相关性黄斑变性病症(Wetage-relatedmaculardegeneration)等几种疾病的RNAi治疗已进入二期和三期临床试验。另外针对乙型肝炎(HepatitisB)、实体瘤(solidtumors)以及先天性厚甲症(Pachyonychiacongenita)等疾病的RNAi药物也已进入一期或二期临床试验。RNAi中的关键功能分子是长度约为21个核苷酸的siRNA，最初应用时主要依靠化学方法合成，这种方法获得的siRNA虽然能有效抑制目的基因的表达，但容易被细胞代谢清除，作用持续时间较短，且合成成本较高，每毫克siRNA的化学合成成本需要上千元。为了长期稳定表达siRNA，研究人员设计开发出了由细胞内自身的RNA聚合酶Ⅲ(RNApolymeraseⅢ)启动子，如H1，U6等转录产生的siRNA表达载体。其中目前应用最广的是shRNA(shorthairpinRNA)。转录产生的shRNA被细胞内的核酸酶Dicer进一步加工后产生成熟的siRNA，发挥沉默靶基因表达的效果。目前使用的shRNA载体由于其自身特点而在实际应用时存在一些缺点，主要包括：(1)效率不高。往往需要设计多个shRNA才能保证有1-2个shRNA能对靶基因达到70％以上的抑制效果。(2)脱靶作用(off-target)。siRNA通过与mRNA部分互补配对，以类似miRNA的作用方式非特异性抑制靶基因以外其它基因的表达。综上所述，本领域急需开发对靶基因抑制效率更高的RNAi载体，从而更好地应用于科学研究和疾病治疗。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种可以引发RNA干扰(RNAi)的新型shRNA表达载体及其制备方法和应用，所述shRNA表达载体的加工效率和对靶基因的抑制效率更高，因此在研究基因功能和基因治疗等方面具有极大潜力。在第一方面，本专利技术提供一种核酶增强型shRNA，所述核酶增强型shRNA的核苷酸序列从5′端到3′端依次具有以下区域：(a)5′端配对区域，所述5′端配对区域长度大于或等于19nt；(b)顶端环区域，所述顶端环区域长度大于或等于2nt；(c)3′端配对区域，所述3′端配对区域长度大于或等于19nt，并且所述5′端配对区域与3′端配对区域形成双链区域，所述双链区域长度大于或等于19bp；(d)3′端未配对区域，所述3′端未配对区域长度为0-6nt；(e)与3′端未配对区域相连的核酶区，所述核酶区编码具有自切割功能的核酶；其中，所述核酶增强型shRNA产生siRNA，且所述siRNA的核苷酸序列对应于所述3′端配对区域或5′端配对区域。在另一优选例中，所述5′端配对区域长度为19-28nt，更佳地为20-25nt。在另一优选例中，所述顶端环区域长度为2-12nt，更佳地为3-10nt。在另一优选例中，所述3′端配对区域长度为19-28nt，更佳地为20-25nt，并且所述5′端配对区域与3′端配对区域形成双链区域，所述双链区域长度为19-28bp，更佳地为20-25bp。在另一优选例中，所述的3′端配对区域为shRNA的靶向链(guidestrand)。在另一优选例中，所述的3′端未配对区域为2nt。在另一优选例中，所述的核酶的3′端具有4-6个连续的U。在另一优选例中，所述核酶增强型shRNA中顶端环长度为4-10nt。在另一优选例中，所述3′端未配对区域长度为1-6nt，更佳地为2-4nt。在另一优选例中，所述核酶选自下组：HDV核酶、发夹状核酶、锤头状核酶。在另一优选例中，所述核酶是HDV核酶。在另一优选例中，所述的核酶是具有自切割功能的HDV核酶。在第二方面，本专利技术提供一种表达盒，所述表达盒包含本专利技术第一方面所述的核酶增强型shRNA的编码序列以及与所述编码序列操作性相连的启动子和终止信号。在另一优选例中，所述表达盒在转录后产生本专利技术第一方面所述的核酶增强型shRNA。在第三方面，本专利技术提供一种构建物，所述构建物包含本专利技术第二方面所述的表达盒。在第四方面，本专利技术提供一种细胞，所述细胞包含本专利技术第一方面所述的核酶增强型shRNA或本专利技术第二方面所述的表达盒或本专利技术第三方面所述的构建物。在另一优选例中，所述的细胞为哺乳动物细胞。在第五方面，本专利技术提供一种产生siRNA的方法，所述方法包括：1)将本专利技术第一方面所述的核酶增强型shRNA或本专利技术第二方面所述的表达盒或本专利技术第三方面所述的构建物转入哺乳动物细胞；和2)培养所述哺乳动物细胞，从而在所述哺乳动物细胞中产生siRNA。在另一优选例中，所述方法还包括从所述哺乳动物细胞中得到产生的siRNA。在另一优选例中，所述方法在体外、为非治疗目的而实施。在另一优选例中，所述方法是非诊断和非治疗的。在第六方面，本专利技术提供一种在哺乳动物细胞中实施RNAi的方法，所述方法包括：将本专利技术第一方面所述的核酶增强型shRNA或本专利技术第二方面所述的表达盒或本专利技术第三方面所述的构建物转入哺乳动物细胞。在第七方面，本专利技术提供一种组合或组合物，所述组合或组合物包含：1)本专利技术第一方面所述的核酶增强型shRNA或本专利技术第二方面所述的表达盒或本专利技术第三方面所述的构建物；和2)适合将1)所述的核酶增强型shRNA或表达盒或构建物导入哺乳动物细胞的其它试剂；所述组合或组合物在导入哺乳动物细胞后产生siRNA或实施RNAi。在另一优选例中，所述组合物还包含Dicer蛋白。在第八方面，本专利技术提供一种用于实施RNA干扰或产生siRNA的试剂盒，所述试剂盒包括：1)容器，所述容器中装有本专利技术第一方面所述的核酶增强型shRNA或本专利技术第二方面所述的表达盒或本专利技术第三方面所述的构建物；和2)使用说明书，所述说明书记载了利用所述试剂盒产生siRNA或实施RNA干扰的方法。在第九方面，本专利技术提供本专利技术第一方面所述的核酶增强型shRNA或本专利技术第二方面所述的表达盒或本专利技术第三方面所述的构建物在哺乳动物细胞中产生siRNA，从而实施RNA干扰，进而能特异性地调控靶基因表达中的应用。在第十方面，本专利技术提供本专利技术第一方面所述的核酶增强型shRNA或本专利技术第二方面所述的表达盒或本专利技术第三方面所述的构建物在制备在哺乳动物细胞中实施RNA干扰的本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种核酶增强型shRNA，所述核酶增强型shRNA的核苷酸序列从5′端到3′端依次具有以下区域：(a)5′端配对区域，所述5′端配对区域长度大于或等于19nt；(b)顶端环区域，所述顶端环区域长度大于或等于2nt；(c)3′端配对区域，所述3′端配对区域长度大于或等于19nt，并且所述5′端配对区域与3′端配对区域形成双链区域，所述双链区域长度大于或等于19bp；(d)3′端未配对区域，所述3′端未配对区域长度为0‑6nt；(e)与3′端未配对区域相连的核酶区，所述核酶区编码具有自切割功能的核酶，其中，所述核酶增强型shRNA产生siRNA，且所述siRNA的核苷酸序列对应于所述3′端配对区域或5′端配对区域。

【技术特征摘要】
1.一种核酶增强型shRNA，所述核酶增强型shRNA的核苷酸序列从5′端到3′端依次具有以下区域：(a)5′端配对区域，所述5′端配对区域长度大于或等于19nt；(b)顶端环区域，所述顶端环区域长度大于或等于2nt；(c)3′端配对区域，所述3′端配对区域长度大于或等于19nt，并且所述5′端配对区域与3′端配对区域形成双链区域，所述双链区域长度大于或等于19bp；(d)3′端未配对区域，所述3′端未配对区域长度为0-6nt；(e)与3′端未配对区域相连的核酶区，所述核酶区编码具有自切割功能的核酶，其中，所述核酶增强型shRNA产生siRNA，且所述siRNA的核苷酸序列对应于所述3′端配对区域或5′端配对区域。2.如权利要求1所述的核酶增强型shRNA，其特征在于，所述核酶增强型shRNA中顶端环长度为2-10nt。3.如权利要求1所述的核酶增强型shRNA，其特征在于，所述3′端未配对区域长度为1-6nt。4.如权利要求1-3中任一项所述的核酶增强型shRNA，其特征在于，所述核酶选自下组：HDV核酶、发夹状核酶、锤头状核酶。5.一种表达盒，所述表达盒包含权利要...

【专利技术属性】
技术研发人员：吴立刚，尚仁福，徐蓓英，
申请(专利权)人：中国科学院上海生命科学研究院，
类型：发明
国别省市：上海,31