一种CHO细胞培养方法技术

本发明专利技术提供一种CHO细胞培养方法，该方法先实现了细胞培养密度的最大化，减少了细胞培养的体积，减少了后续的劳动强度，质量均一稳定，生产过程衔接紧密，易操控。本发明专利技术在细胞培养和病毒增殖过程中进行补液，保证了细胞增殖所需的营养物质，又提高了营养液的利用率，节约成本。按照本发明专利技术的腺病毒载体疫苗生产工艺，病毒滴度可达到8×10

【技术实现步骤摘要】
一种CHO细胞培养方法
本专利技术涉及细胞工程
，具体涉及一种CHO细胞培养方法。
技术介绍
CHO细胞虽可像微生物细胞一样，在人工控制条件的生物反应器中进行大规模培养，但其细胞结构和培养特性与微生物细胞相比，有显著差别。动物细胞比微生物细胞大得多，无细胞壁，机械强度低，对剪切力敏感，适应环境能力差；倍增时间长，生长缓慢，易受微生物污染，培养时须用抗生素；培养过程需氧量少，培养过程中细胞相互粘连以集群形式存在；原代培养细胞一般繁殖50代即退化死亡；代谢产物具有生物活性，生产成本高，但附加值也高。现有技术中，实验证实细胞传代次数过多对CHO细胞单层培养方式下细胞的生长以及腺病毒载体的表达量产生了明显的影响，但是对于悬浮培养方式下CHO细胞的生长以及腺病毒载体的表达量确没有影响，但是现有技术针对CHO细胞悬浮培养工艺鲜有报道。
技术实现思路
本专利技术的目的是克服现有技术缺陷，提供一种CHO细胞培养方法。为实现以上技术目的，本专利技术采用以下技术方案：一种CHO细胞培养方法，包括以下步骤：1)用搅拌式细胞培养瓶培养CHO细胞并制成细胞悬液；2)将步骤1)的细胞悬液移入小规模反应器进行无血清悬浮培养；3)将步骤2)的细胞悬液移入大规模反应器进行无血清悬浮培养；上述制备方法，在步骤1)中，CHO细胞为已经驯化的适用于全悬浮培养的细胞系。从细胞工作中以液氮库中复苏CHO细胞，现在T形组织培养瓶中传代扩增，在培养到搅拌式细胞培养瓶，进而消化转瓶细胞转移到小规模反应器中进行培养，在搅拌式细胞培养瓶或小规模反应器中放大动物细胞数量，挑选形态健康、生长良好的细胞作为下级反应器的种子细胞。作为优选，步骤2)中，将挑选形态健康、生长良好的转瓶生产细胞用胰蛋白酶消化液消化，用无血清细胞培养基悬浮培养制成细胞悬液，按0.5～1.5×106cells/ml的密度接种反应器，通过生物反应器上的相应同期系统，通过微机有序地定量地控制加入细胞培养罐内的空气、氧气、氮气、和二氧化碳四种气体的流量，使其保持最佳的比例来控制细胞培养液的温度、培养液pH、融氧水平，使细胞生长于最适宜环境进行细胞培养。无血清悬浮培养的条件是：起始接种细胞密度0.6×106cells/ml；培养温度在36～38℃；ph维持在7.0～7.4之间；溶氧浓度在40％～50％之间；搅拌速度在100～135rpm之间，在培养的第1～3天搅拌速度设置为100～120rpm，自培养第4天开始在110～135rpm的范围内逐步提高搅拌速度。作为优选，该方法采用的生物反应器悬浮培养方法为灌注式培养方式，每24小时补充20％(v/v)的细胞培养基。本专利技术提供的技术方案填补了CHO细胞悬浮培养技术的技术空白，所选培养条件适于CHO细胞生长，实现了细胞培养密度的最大化，减少了细胞培养的体积，减少了后续的劳动强度，质量均一稳定,生产过程衔接紧密，易操控。本专利技术在细胞培养和病毒增殖过程中进行补液，保证了细胞增殖所需的营养物质，又提高了营养液的利用率，节约成本。具体实施方式实施例1一种CHO细胞培养方法，包括以下步骤：1)用搅拌式细胞培养瓶培养CHO细胞并制成细胞悬液；2)将步骤1)的细胞悬液移入小规模反应器进行无血清悬浮培养；3)将步骤2)的细胞悬液移入大规模反应器进行无血清悬浮培养；上述制备方法，在步骤1)中，CHO细胞为已经驯化的适用于全悬浮培养的细胞系。从细胞工作中以液氮库中复苏CHO细胞，现在T形组织培养瓶中传代扩增，在培养到搅拌式细胞培养瓶，进而消化转瓶细胞转移到小规模反应器中进行培养，在搅拌式细胞培养瓶或小规模反应器中放大动物细胞数量，挑选形态健康、生长良好的细胞作为下级反应器的种子细胞。步骤2)中,将挑选形态健康、生长良好的转瓶生产细胞用胰蛋白酶消化液消化，用无血清细胞培养基悬浮培养制成细胞悬液，按0.5～1.5×106cells/ml的密度接种反应器，通过生物反应器上的相应同期系统，通过微机有序地定量地控制加入细胞培养罐内的空气、氧气、氮气、和二氧化碳四种气体的流量，使其保持最佳的比例来控制细胞培养液的温度、培养液pH、融氧水平，使细胞生长于最适宜环境进行细胞培养。无血清悬浮培养的条件是：起始接种细胞密度0.6×106cells/ml；培养温度在36～38℃；ph维持在7.0～7.4之间；溶氧浓度在40％～50％之间；搅拌速度在100～135rpm之间，在培养的第1～3天搅拌速度设置为100～120rpm，自培养第4天开始在110～135rpm的范围内逐步提高搅拌速度。该方法采用的生物反应器悬浮培养方法为灌注式培养方式，每24小时补充20％(v/v)的细胞培养基。实施例2一种CHO细胞培养方法，包括以下步骤：1)用搅拌式细胞培养瓶培养CHO细胞并制成细胞悬液；2)将步骤1)的细胞悬液移入小规模反应器进行无血清悬浮培养；3)将步骤2)的细胞悬液移入大规模反应器进行无血清悬浮培养；上述制备方法，在步骤1)中，CHO细胞为已经驯化的适用于全悬浮培养的细胞系。从细胞工作中以液氮库中复苏CHO细胞，现在T形组织培养瓶中传代扩增，在培养到搅拌式细胞培养瓶，进而消化转瓶细胞转移到小规模反应器中进行培养，在搅拌式细胞培养瓶或小规模反应器中放大动物细胞数量，挑选形态健康、生长良好的细胞作为下级反应器的种子细胞。以上对本专利技术的实施例进行了详细说明，但所述内容仅为本专利技术的较佳实施例，并不用以限制本专利技术。凡在本专利技术的申请范围内所做的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本专利技术的保护范围之内。本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种CHO细胞培养方法，其特征在于包括以下步骤：1)用搅拌式细胞培养瓶培养CHO细胞并制成细胞悬液；2)将步骤1)的细胞悬液移入小规模反应器进行无血清悬浮培养；3)将步骤2)的细胞悬液移入大规模反应器进行无血清悬浮培养；上述制备方法，在步骤1)中，CHO细胞为已经驯化的适用于全悬浮培养的细胞系。从细胞工作中以液氮库中复苏CHO细胞，现在T形组织培养瓶中传代扩增，在培养到搅拌式细胞培养瓶，进而消化转瓶细胞转移到小规模反应器中进行培养，在搅拌式细胞培养瓶或小规模反应器中放大动物细胞数量，挑选形态健康、生长良好的细胞作为下级反应器的种子细胞。

【技术特征摘要】
1.一种CHO细胞培养方法，其特征在于包括以下步骤：1)用搅拌式细胞培养瓶培养CHO细胞并制成细胞悬液；2)将步骤1)的细胞悬液移入小规模反应器进行无血清悬浮培养；3)将步骤2)的细胞悬液移入大规模反应器进行无血清悬浮培养；上述制备方法，在步骤1)中，CHO细胞为已经驯化的适用于全悬浮培养的细胞系。从细胞工作中以液氮库中复苏CHO细胞，现在T形组织培养瓶中传代扩增，在培养到搅拌式细胞培养瓶，进而消化转瓶细胞转移到小规模反应器中进行培养，在搅拌式细胞培养瓶或小规模反应器中放大动物细胞数量，挑选形态健康、生长良好的细胞作为下级反应器的种子细胞。2.根据权利要求1所述的CHO细胞培养方法，其特征在于步骤2)中,将挑选形态健康、生长良好的转瓶生产细胞用胰蛋白酶消化液消化，用无血清细胞培养基悬浮培养制成细胞悬液，按0.5～1...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘鼎阔，王立红，张凤洪，张俊霞，
申请(专利权)人：鼎正生物药业天津有限公司，
类型：发明
国别省市：天津,12