一种仔猪小肠上皮细胞分级分离方法技术

本发明专利技术公开了一种仔猪肠上皮细胞分级分离方法，包括以下步骤：1、取长度为60‑90cm小肠肠段，肠腔中灌注37℃预热充氧磷酸缓冲液100‑150mL，两端用止血钳夹住后，于37℃水浴振荡器中孵育30分钟，震荡速度为70转/分钟；2、弃磷酸盐缓冲液，灌注细胞分离液100‑150mL，继续于37℃水浴振荡器中分别孵育2.5小时，震荡速度为70转/分钟，分别于不同时间点收集细胞分离液并灌注新的细胞分离液；3、所收集细胞分离液于4℃、400g离心10分钟，所得沉淀即为肠上皮细胞，根据孵育时间由前至后收集的细胞依次为沿隐窝‑绒毛轴从绒毛顶端至隐窝底部不同部位细胞。本发明专利技术分离的细胞为体内研究小肠上皮细胞分化机制、营养吸收代谢和相关疾病药物开发提供了新的技术方法。

Method for grading and separating piglet intestinal epithelial cells

The invention discloses a method for separating piglets epithelial cell grade, which comprises the following steps: 1, the length of 60 90cm intestinal segment, intestinal perfusion at 37 oxygen preheating phosphate buffer 150mL 100, both ends of the use of hemostatic clamp after in 37 DEG C water bath oscillator and incubated for 30 minutes shock, speed is 70 rpm; 2, abandoned the phosphate buffer solution 100 150mL isolated perfusion cells continue to 37 DEG C water bath oscillator were incubated for 2.5 hours, the shock speed is 70 rpm, respectively at different time points were collected and separated liquid perfusion new cells separated from the liquid; 3 and the collected cell separating liquid at 4 deg C, 400g centrifugal 10 minutes, the precipitation is the intestinal epithelial cells, depending on the incubation time from anterior to posterior cells were collected along the crypt villus axis different from the top to the bottom of the crypt villus cells. The isolated cells of the invention provide a new technical method for studying the mechanism of intestinal epithelial cell differentiation, nutrient absorption, metabolism and related diseases in vivo.

【技术实现步骤摘要】
一种仔猪小肠上皮细胞分级分离方法
本专利技术属于生物
，具体涉及一种仔猪小肠上皮细胞分级分离方法。
技术介绍
肠道上皮是肠道与外部坏境直接接触的选择性屏障，在营养物质消化吸收和抵御细菌等病原体的入侵中发挥至关重要的作用。小肠上皮细胞处于一个不断更新的过程中，分化成熟的绒毛顶端上皮细胞不断凋亡排入肠腔，位于隐窝的干细胞则不断分裂产生新的细胞，并沿隐窝-绒毛轴迁移补充凋亡的上皮细胞，维持肠道上皮的稳定，而肠道上皮的相对稳定是维持其功能的基础。研究小肠粘膜生长和成熟的关键就是研究上皮细胞的增殖、分化和凋亡的过程。目前有关小肠上皮细胞增殖和分化的过程与机制的研究大多集中于体外培养的细胞系，体内的研究很少。体内肠上皮细胞分化受遗传和营养的因素影响，与体外培养的细胞具有一定的区别，特别是在肠道发育迅速的幼年阶段。仅有的少数体内研究主要是以小鼠和大鼠等啮齿动物为模型，使用免疫组化等技术研究少量基因表达或蛋白质合成等变化，无法实现对肠细胞分化过程中相关生理过程和代谢变化的高通量研究。且由于怀孕期较短，啮齿动物肠道发育模式和人体具有较大的差别，以啮齿动物为模型研究人体肠上皮细胞分化过程和发育性变化具有很大的局限性。与啮齿动物等动物模型相比，仔猪肠道发育过程和肠上皮细胞组成及发育性变化与人体最为接近，是研究人肠上皮细胞分化和肠道发育及相关疾病的理想模型。此外，仔猪肠道发育与健康调控也是生猪生产中的核心问题，研究仔猪肠道发育对生猪生产也具有重要的指导意义。
技术实现思路
本专利技术旨在克服现有技术的不足，提供一种种仔猪小肠上皮细胞分级分离方法。为了达到上述目的，本专利技术提供的技术方案为：所述种仔猪小肠上皮细胞分级分离方法包括以下步骤：(1)向60-90cm仔猪小肠肠段的肠腔中灌注37℃预热充氧的磷酸缓冲液100-150mL，用止血钳夹住肠段两端后将肠段于37℃水浴振荡器中孵育25—35分钟，优选30分钟，孵育时的震荡速度为65—75转/分钟，优选70转/分钟；(2)除去肠腔中的磷酸盐缓冲液，向肠腔中灌注细胞分离液100-150mL后将肠段于37℃水浴振荡器中孵育2—3小时，优选2.5小时，孵育时的震荡速度为65—75转/分钟，优选70转/分钟，根据肠段部位在孵育的不同时间点收集细胞分离液并向肠腔中灌注新的细胞分离液；(3)将收集的细胞分离液于4℃离心，所得沉淀即为肠上皮细胞。其中，所述仔猪为0-70日龄乳仔猪。优选地，所述磷酸盐缓冲液中各组分及浓度如下：氯化钠135-150mM、磷酸二氢钠4-6mM,磷酸氢二钠4-6mM，苯甲基磺酰氟0.1-0.3mM，二硫苏糖醇0.4-0.6mM。所述细胞分离液中各组分及浓度如下：氯化钠115-125mM、氯化钾4.6-5.0mM、硫酸镁1.0-1.5mM、磷酸二氢钾1.0-1.5mM、碳酸氢钠20-30mM、4-羟乙基哌嗪乙磺酸8-12mM、D-葡萄糖1-4mM、谷氨酰胺1.0-5.0mM、谷氨酸0.5-2.5mM、乙二胺四乙酸二钠3.5-6.5mM、二硫苏糖醇0.4-0.6mM，牛血清白蛋白的重量百分比浓度为0.25％。所述根据肠段部位在不同时间点收集细胞分离液是：肠段绒毛顶端分化成熟上皮细胞在孵育10-40分钟时收集细胞分离液、绒毛中部正在分化上皮细胞在孵育41-90分钟时收集细胞分离液、隐窝增殖上皮细胞在孵育91-150分钟时收集细胞分离液。优选地，绒毛上部上皮细胞在孵育20分钟和40分钟时收集细胞分离液(即，在20分钟和40分钟两个时间点两次收集)；绒毛中部上皮细胞在孵育65分钟和90分钟时收集细胞分离液(即，在65分钟和90分钟两个时间点两次收集)；隐窝上皮细胞在孵育120分钟和150分钟收集细胞分离液(即，在120分钟和150分钟两个时间点两次收集)。所述磷酸盐缓冲液和细胞分离液的pH值为7.4。步骤(3)所述离心的条件为：4℃、400g离心10—15分钟，优选为10分钟。与现有技术相比，本专利技术的有益效果为：1、通过确定不同细胞收集时间点上皮细胞的成熟程度，建立仔猪隐窝-绒毛轴小肠上皮细胞分级分离方法，为体内研究仔猪小肠上皮细胞分化过程提供了新的方法；2、细胞分离液优选仔猪小肠上皮细胞供能物质D-葡萄糖、谷氨酰胺、谷氨酸和乙二胺四乙酸二钠及浓度，维持肠上皮细胞正常生理功能；3、本专利技术操作简单，所需仪器设备为实验室常规仪器设备，成本低廉；4、本专利技术与转录组学、蛋白组学和代谢组学等高通量技术结合可实现对仔猪小肠上皮细胞分化过程的高通量分析；5、本专利技术以仔猪为研究对象，是研究人体小肠上皮细胞分化和肠道发育的优秀模型。附图说明图1为0日龄哺乳仔猪小肠隐窝-绒毛轴上皮细胞碱性磷酸酶活性图；图2为25日龄断奶仔猪小肠隐窝-绒毛轴上皮细胞碱性磷酸酶活性图；图3为70日龄仔猪小肠隐窝-绒毛轴上皮细胞碱性磷酸酶活性图。具体实施方式实施例1所述仔猪肠上皮细胞分级分离方法包括如下步骤：(1)选取0日龄哺乳仔猪6头，屠宰后剪取长度为60cm仔猪小肠肠段，肠腔中灌注37℃预热充氧磷酸缓冲液100mL，两端用止血钳夹住后，于37℃水浴振荡器中孵育30分钟，震荡速度为70转/分钟；其中，磷酸盐缓冲液组成为：氯化钠150mM、磷酸二氢钠4mM,磷酸氢二钠4mM，苯甲基磺酰氟0.1mM，二硫苏糖醇0.4mM，pH值7.4。(2)弃磷酸盐缓冲液，灌注细胞分离液100mL，继续于37℃水浴振荡器中分别孵育2.5小时，震荡速度为70转/分钟，分别于孵育后20分钟、40分钟、65分钟、90分钟、120分钟和150分钟收集细胞分离液并灌注新的细胞分离液；其中，细胞分离液组成为：氯化钠125mM、氯化钾4.6mM、硫酸镁1.0mM、磷酸二氢钾1.5mM、碳酸氢钠20mM、4-羟乙基哌嗪乙磺酸8mM、D-葡萄糖1mM、谷氨酰胺1.0mM、谷氨酸0.5mM、乙二胺四乙酸二钠3.5mM、二硫苏糖醇0.4mM、牛血清白蛋白0.25％，pH值7.4。1)所收集细胞分离液于4℃、400g离心10分钟，收集沉淀的小肠上皮细胞。通过检测小肠上皮细胞分化标志碱性磷酸酶活性发现本方法有效地分离了隐窝-绒毛轴不同分化程度肠上皮细胞(图1)。实施例2所述仔猪肠上皮细胞分级分离方法包括如下步骤：(1)选取25日龄断奶仔猪6头，屠宰后剪取长度为80cm仔猪小肠肠段，肠腔中灌注37℃预热充氧磷酸缓冲液110mL，两端用止血钳夹住后，于37℃水浴振荡器中孵育30分钟，震荡速度为70转/分钟；其中，磷酸盐缓冲液组成为：氯化钠142mM、磷酸二氢钠5mM,磷酸氢二钠5mM，苯甲基磺酰氟0.2mM，二硫苏糖醇0.5mM，pH值7.4。(2)弃磷酸盐缓冲液，灌注细胞分离液110mL，继续于37℃水浴振荡器中分别孵育2.5小时，震荡速度为70转/分钟，分别于孵育后20分钟、40分钟、60分钟、90分钟、115分钟和150分钟收集细胞分离液并灌注新的细胞分离液；其中，细胞分离液组成为：氯化钠120mM、氯化钾4.8mM、硫酸镁1.25mM、磷酸二氢钾1.25mM、碳酸氢钠25mM、4-羟乙基哌嗪乙磺酸10mM、D-葡萄糖2mM、谷氨酰胺5.0mM、谷氨酸0.5mM、乙二胺四乙酸二钠5mM、二硫苏糖醇0.5mM、牛血清白蛋白0.25％，pH值7.4。3)所收本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种仔猪肠上皮细胞分级分离方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：(1)向60‑90cm仔猪小肠肠段的肠腔中灌注37℃预热充氧的磷酸缓冲液100‑150mL，用止血钳夹住肠段两端后将肠段于37℃水浴振荡器中孵育25—35分钟，孵育时的震荡速度为65—75转/分钟；(2)除去肠腔中的磷酸盐缓冲液，向肠腔中灌注细胞分离液100‑150mL后将肠段于37℃水浴振荡器中孵育2—3小时，孵育时的震荡速度为65—75转/分钟，根据肠段部位在孵育的不同时间点收集细胞分离液并向肠腔中灌注新的细胞分离液；(3)将收集的细胞分离液于4℃离心，所得沉淀即为肠上皮细胞。

【技术特征摘要】
1.一种仔猪肠上皮细胞分级分离方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：(1)向60-90cm仔猪小肠肠段的肠腔中灌注37℃预热充氧的磷酸缓冲液100-150mL，用止血钳夹住肠段两端后将肠段于37℃水浴振荡器中孵育25—35分钟，孵育时的震荡速度为65—75转/分钟；(2)除去肠腔中的磷酸盐缓冲液，向肠腔中灌注细胞分离液100-150mL后将肠段于37℃水浴振荡器中孵育2—3小时，孵育时的震荡速度为65—75转/分钟，根据肠段部位在孵育的不同时间点收集细胞分离液并向肠腔中灌注新的细胞分离液；(3)将收集的细胞分离液于4℃离心，所得沉淀即为肠上皮细胞。2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述仔猪为0-70日龄乳仔猪。3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述磷酸盐缓冲液中各组分及浓度如下：氯化钠135-150mM、磷酸二氢钠4-6mM,磷酸氢二钠4-6mM，苯甲基磺酰氟0.1-0.3mM，二硫苏糖醇0.4-0.6mM。4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述细胞分离液中各组分及浓度如下：氯化钠115-125mM、氯化钾4.6-5.0mM、硫酸镁1.0-1.5mM、磷酸二氢钾1.0-1.5mM、碳酸氢钠20-30mM、4-羟乙基哌...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨焕胜，印遇龙，李建中，
申请(专利权)人：湖南师范大学，
类型：发明
国别省市：湖南,43