本发明专利技术涉及一种NK细胞的制备方法，该方法利用聚肌胞可诱导免疫细胞的分化、成熟或者分泌细胞因子，如IL‑12、IL‑15、TNFa、IFN‑r等，促进免疫细胞的活化增殖的能力。利用聚肌胞还可以促进膜结合型IL‑15Ra表达的能力，IL‑15Ra可与IL‑15紧密结合，这种结合状态的IL‑15对NK细胞有更强烈的促活化和促增殖的效应，将聚肌胞用于诱导培养NK细胞。本发明专利技术诱导培养的NK细胞满足了临床应用对细胞数量和细胞活性的要求。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于细胞培养
，涉及一种NK细胞的制备方法。
技术介绍
自然杀伤细胞(Natural Killer cell,NK)是机体重要的免疫细胞，在机体抗肿瘤、抗病毒等过程中发挥重要作用。NK细胞通过非特异性识别靶细胞，通过分泌颗粒酶、穿孔素、细胞因子等途径杀伤靶细胞。同时NK细胞表达FcγRⅢA，与抗体分子的Fc段结合，通过抗体实现对靶细胞的特异性识别和杀伤。因此，NK细胞在肿瘤或者病毒性疾病的治疗上有很大的应用价值。直接从体内分离出来的NK细胞往往面临数量上和功能上的不足，需要在体外进行大量的扩增和活化才能回输到体内去，达到治疗的效果。NK细胞的扩增和活化主要是通过以下几个途径实现的：1、ζ链活化途径。NK细胞虽不表达TCR-CD3复合物，但部分NK细胞表达ζ链。ζ链和NK表面的IgGFc受体FcγRⅢ(CDl6)形成复合体。Ig分子和FcγRⅢ结合时，ζ链胞内段上的ITAM即可发生酪氨酸磷酸化，通过信号转导通路引起胞质内Ca2+浓度和IP3水平升高，促进细胞因子合成和ADCC效应。外周血中的NK细胞几乎均可通过此途径活化。部分NK细胞表达CD2分子，还有可能通过CD2与CD58相互作用可使ζ链发生酪氨酸磷酸化，使NK细胞活化。2、IL-2R激活途径。NK细胞表面表达IL-2Rβγ链，在IL-2的诱导下，NK细胞开始大量表达IL-2Rα链，βγ链与α链的结合有利于形成高亲和力IL-2受体，从而使NK细胞在IL-2的刺激下进一步发生增殖。在IL 2刺激下NK细胞表达黏附分子，使NK胞质中的颗粒增加并促进丝氨酸酯酶mRNA的表达，从而提高NK细胞的细胞毒活性。3、IL-18和Il-12激活途径。ILl8和IL12共同作用，通过胞内的ITAM而达到促进NK细胞活化的作用。4、IL-15激活途径。IL-15与IL-2有相似的结构，对NK细胞的活化和增殖有促进作用。5、IL-21激活途径。IL21分子结构与IL-15相似，协同IL-15促进NK细胞增殖、分化和细胞毒活性。6、除了上述外加的细胞因子外，一些Tall样受体(TLR)激动剂如OK432、Poly(i:c)、LPS等作用于树突状细胞、单核细胞、巨噬细胞或NK细胞本身，诱导这些细胞的分化、成熟或者分泌细胞因子，如IL-12、IL-15、TNFa、IFN-r等，促进NK细胞的活化增殖。Poly(i:c)还可以促进膜结合型IL-15Ra表达，IL-15Ra可与IL-15紧密结合，这种结合状态的IL-15对NK细胞有更强烈的促活化和促增殖的效应。现有的NK细胞扩增和活化培养体系诱导培养的NK细胞扩增倍数低、存活时间短、活性低，不能满足临床应用。
技术实现思路
本专利技术的目的在于针对现有NK细胞扩增和活化培养体系诱导培养的NK细胞扩增倍数低、存活时间短、活性低，不能满足临床应用的问题，提供了一种NK细胞的分离培养方法，该方法利用聚肌胞[Poly(I:C)]可诱导免疫细胞的分化、成熟或者分泌细胞因子，如IL-12、IL-15、TNFa、IFN-r等，促进免疫细胞的活化增殖的能力。利用聚肌胞还可以促进膜结合型IL-15Ra表达的能力，IL-15Ra可与IL-15紧密结合，这种结合状态的IL-15对NK细胞有更强烈的促活化和促增殖的效应，将聚肌胞用于诱导培养NK细胞。利用该方法诱导培养的NK细胞满足了临床应用对细胞数量和细胞活性的要求。本专利技术的技术方案是：步骤一，采集患者外周血，分离并收集外周血单个核细胞并用NK细胞无血清培养基接种于培养瓶中，并加入2％热灭活自体血浆；步骤二：培养第1天加入0.1-1000μg/ml聚肌胞；培养第2天加入CD16单抗1-200ng/ml、10-5000IU/ml IL-2、0.1-100ng/ml IL-18、0.1-100ng/ml IL-15；第5天根据细胞增殖情况，调整细胞密度，加入2％热灭活自体血浆、10-5000IU/ml IL-2、0.1-100ng/ml IL-18、0.1-100ng/ml IL-15、0.01-100ng/ml IL-12；步骤三：以后每2-3天补液一次，根据细胞增殖情况，调整细胞密度，加入2％热灭活自体血浆、10-5000IU/ml IL-2、0.1-100ng/ml IL-18、0.1-100ng/ml IL-15、0.01-100ng/ml IL-12；步骤四：培养至15-20天，回收细胞。优选的，步骤一至步骤三添加的聚肌胞的浓度为10μg/ml，CD16单抗的浓度为20ng/ml，IL-2的浓度为500IU/ml、IL-18的浓度为10ng/ml、IL-15的浓度为10ng/ml、IL-12的浓度为1ng/ml。优选的，培养过程中调整细胞密度为1×106/ml。优选的，利用本专利技术的技术方案培养的NK细胞用于恶性肿瘤的治疗。与现有技术相比，本专利技术具有有益效果为：本专利技术诱导培养的NK细胞满足了临床应用对细胞数量和细胞活性的要求。附图说明图1为实施例1-3与对比例1-3NK细胞第5-20天的增殖曲线的结果；图2为实施例1-3与对比例1-3得到的NK细胞杀瘤实验的结果；图3为实施例1-3与对比例1-3得到的NK细胞比例的结果；具体实施方式以下通过实施例对本专利技术作进一步的说明，但本专利技术并不限于这些具体实施方式。实施例1步骤一：用ficoll淋巴细胞分离液分离外周血单个核细胞(PBMC)，收集分离液上层血浆，56℃灭活30分钟，离心后取上清得到热灭活自体血浆；中间层单个核细胞用生理盐水洗2次后得到外周血单个核细胞(PBMC)。取PBMC用NK细胞无血清培养基(购自英普乐孚生物技术(上海)有限公司)调整细胞浓度为2×106/ml，加入2％热灭活自体血浆，接种到培养瓶中培养。步骤二：培养第1天加入10μg/ml Poly(I:C)(Sigmaaldrich，P9582-50MG)；培养第2天加入20ng/ml CD16单抗(ebioscience,16-0167-85)、500IU/ml IL-2、10ng/mlIL-18(R&D systems,B001-5)、10ng/ml IL-15(R&D systems，247-ILB-025)；培养第5天根据细胞增殖情况，用含2％自体血浆NK细胞无血清培养基调整细胞密度为1×106/ml，加入500IU/ml IL-2、10ng/mlIL-18、10ng/ml IL-15；1ng/ml IL-12(R&D systems,219-IL-025)步骤三：每2-3天补液一次，根据细胞增殖情况，用含2％自体血浆NK细胞无血清培养基调整细胞密度为1×106/ml，加入500IU/ml IL-2、10ng/mlIL-18、10ng/ml IL-15、1ng/ml IL-12；步骤四：细胞培养至15-20天，收集细胞，生理盐水洗2次，用于回输患者体内或者冻存。实施例2～3NK细胞诱导培养的操作过程同实施例1的，不同之处在于：Poly(I:C)、CD16单抗、IL-2、IL-18、IL-15、IL-12的浓度不同。实施例2：Poly(I:C)的浓度为0.1μg/m本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种NK细胞的制备方法，其特征在于，包括下述步骤：步骤一，采集患者外周血，分离并收集外周血单个核细胞并用NK细胞无血清培养基接种于培养瓶中，并加入2％热灭活自体血浆；步骤二：培养第1天加入聚肌胞；培养第2天加入CD16单抗、IL‑2、IL‑18、IL‑15；第5天根据细胞增殖情况，调整细胞密度，加入IL‑2、IL‑18、IL‑15、IL‑12和2％热灭活自体血浆；步骤三：以后每2‑3天补液一次，根据细胞增殖情况，调整细胞密度，IL‑2、IL‑18、IL‑15、IL‑12和2％热灭活自体血浆；步骤四：培养至15‑20天，回收细胞。
【技术特征摘要】
1.一种NK细胞的制备方法，其特征在于，包括下述步骤：步骤一，采集患者外周血，分离并收集外周血单个核细胞并用NK细胞无血清培养基接种于培养瓶中，并加入2％热灭活自体血浆；步骤二：培养第1天加入聚肌胞；培养第2天加入CD16单抗、IL-2、IL-18、IL-15；第5天根据细胞增殖情况，调整细胞密度，加入IL-2、IL-18、IL-15、IL-12和2％热灭活自体血浆；步骤三：以后每2-3天补液一次，根据细胞增殖情况，调整细胞密度，IL-2、IL-18、IL-15、IL-12和2％热灭活自体血浆；步骤四：培养至15-20天，回收细胞。2.如权利...
【专利技术属性】
技术研发人员：武宁，谢志明，
申请(专利权)人：英普乐孚生物技术上海有限公司，
类型：发明
国别省市：上海;31
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