去细胞皮瓣及其制备方法和应用技术

本发明专利技术提供了一种去细胞皮瓣及其制备方法和应用，涉及临床医学、生物医学与再生医学的技术领域。本发明专利技术提供的去细胞皮瓣的制备方法，包括依次灌注肝素溶液，Triton X‑100溶液和SDS溶液后，进行干燥、灭菌及保存处理，操作步骤简单，制备耗时短。本发明专利技术提供的去细胞皮瓣，无免疫排斥反应，不涉及剧毒有害化学物质，且具有良好的细胞相容性及组织相容性。本发明专利技术提供的去细胞皮瓣在修补缺损创面及科学研究中的应用，能够实现全厚皮肤及皮下组织缺损的修复，愈合质量好。

Acellular skin flap, preparation method and application thereof

The invention provides a acellular flap and a preparation method and an application thereof, relating to the technical field of clinical medicine, biomedicine and regenerative medicine. Go to cell flap preparation method provided by the invention comprises infusion of heparin solution, Triton 100 X solution and SDS solution, drying, sterilization and preservation treatment, simple operation steps, preparation time is short. The acellular skin flap provided by the invention has no immunological rejection, does not involve highly toxic and harmful chemicals, and has good cell compatibility and tissue compatibility. The application of the acellular skin flap in repairing the defect and the scientific research can realize the repair of the full-thickness skin and the subcutaneous tissue defect, and the healing quality is good.

【技术实现步骤摘要】
去细胞皮瓣及其制备方法和应用
本专利技术涉及临床医学、生物医学与再生医学
，尤其是涉及一种去细胞皮瓣及其制备方法和应用。
技术介绍
烧伤、外伤、手术、慢性溃疡等导致皮肤缺损，而大面积的缺损机体无法自行修复其外观及功能。缺损创面需要利用皮肤移植物进行覆盖，目前临床常用的是自体皮瓣移植。取患者身体其他区域健康的皮肤(供区)，对缺损创面(受区)进行修补。这种方式能有效的覆盖皮肤缺损创面，但常常造成供区受损。随着组织工程的发展，大量人工皮肤替代物涌现。现有的皮肤替代物主要分4类：一种是去细胞真皮：通过去细胞方法去除细胞成分，保留完整的细胞外基质的异体、异种真皮。但是，此种方法具有如下缺点，如异体皮来源有限；有传染疾病的危险且受到伦理学的制约；其中异种去细胞真皮修补创面后创面挛缩明显，创面愈合质量差；结构单薄，无法修复全厚皮肤的缺损；力学性能难于复合操作的要求等。一种是人工合成真皮：由各种生物、化学材料构建的真皮类似物。但是，此种方法具有如下缺点，如水分易丢失；移植后还要再进行二次表皮移植；结构单薄，无法修复全厚皮肤的缺损等。另一种是复合皮替代物：自体刃厚表皮或自体角质形成细胞膜片与真皮替代物在体内体外组合的接近正常皮肤结构的一种皮肤替代物。但是，此种方法具有如下缺点，如Apligraft因含有异体人表皮细胞，存在一定程度的免疫排斥反应；现阶段的研究停留在免疫缺陷的裸鼠模型中；缺少皮下组织的结构，无法修复深层皮肤缺损等。还有一种是去细胞皮瓣：去细胞皮瓣的研究始于2010年，其主要制备方法是血管灌注法。目前现有的去细胞皮瓣的制备方法大致分为以下三种，第1种方法最先报道，具体方法不详，其制备过程中涉及叠氮钠有毒；第2种方法于2015年报道，以灌注法为主，同时辅以振荡法，耗时比较长；第3种方法于2016年报道，灌注NaCl、胰酶、TritonX－100、超纯水等，步骤繁琐，耗时较长。因此，开发一种能够实现全厚皮肤及皮下组织缺损的修复，无免疫排斥反应，不涉及剧毒有害化学物质，操作步骤简单，灌注耗时短，且具有良好的细胞相容性及组织相容性的去细胞皮瓣尤为重要。有鉴于此，特提出本专利技术。
技术实现思路
本专利技术的第一个目的在于提供一种去细胞皮瓣的制备方法，以缓解现有技术中存在的操作步骤繁琐，耗时长的技术问题。本专利技术的第二个目的在于提供一种去细胞皮瓣，以缓解现有技术中存在的包含有毒害化学物质，使受体产生免疫排斥反应，且细胞相容性及组织相容性较差的技术问题。本专利技术的第三个目的在于提供一种去细胞皮瓣在修补缺损创面及科学研究中的应用，以缓解现有技术中不能实现全厚皮肤及皮下组织缺损的修复的技术问题。本专利技术提供的去细胞皮瓣的制备方法，包括如下步骤：取动脉的穿支皮瓣，依次灌注肝素溶液，TritonX－100溶液和SDS溶液；将灌注后的所述穿支皮瓣进行干燥处理、灭菌处理和无菌保存。进一步地，所述动脉为腹壁浅动脉。进一步地，所述灌注的速度为20－40mL/h。进一步地，所述肝素溶液为肝素PBS溶液，所述肝素PBS溶液的浓度为10－20U/mL，所述TritonX－100溶液的浓度为0.3％－2％W/V，所述SDS溶液的浓度为0.1％－1％W/V。进一步地，所述肝素PBS溶液的灌注时间为4－8h，所述TritonX－100溶液的灌注时间为10－14h，所述SDS溶液的灌注时间为10－14h。进一步地，所述干燥处理为将灌注后的所述穿支皮瓣置于真空冷冻干燥机内，所述干燥处理的时间为4－8h。进一步地，所述灭菌处理为将干燥后的所述穿支皮瓣照射60Co－γ射线进行灭菌，所述60Co－γ射线的照射剂量为20－30KGy，所述灭菌处理的时间为1－3h。进一步地，所述无菌保存的温度为－80℃。本专利技术还提供了一种去细胞皮瓣，应用上述的制备方法制备得到。另外，本专利技术还提供了上述的去细胞皮瓣在修补缺损创面及科学研究中的应用。本专利技术提供的去细胞皮瓣的制备方法，操作步骤简单，制备耗时短；本专利技术提供的去细胞皮瓣，无免疫排斥反应，不涉及剧毒有害化学物质，且具有良好的细胞相容性及组织相容性；本专利技术提供的去细胞皮瓣在修补缺损创面及科学研究中的应用，能够实现全厚皮肤及皮下组织缺损的修复，愈合质量好。附图说明图1为本专利技术提供的去细胞皮瓣的外观图；图2A为本专利技术提供的去细胞皮瓣的皮下组织侧HE染色结果图；图2B为本专利技术提供的去细胞皮瓣的表皮真皮侧HE染色结果图；图3为本专利技术提供的去细胞皮瓣的酶联免疫吸附实验结果图；图4为本专利技术提供的去细胞皮瓣的扫描电镜结果图；图5A为正常皮瓣经血管造影术后X射线结果图；图5B为本专利技术提供的去细胞皮瓣经血管造影术后X射线结果图；图6A为本专利技术提供的去细胞皮瓣体外接种内皮细胞后24小时的免疫荧光染色结果图；图6B为本专利技术提供的去细胞皮瓣体外接种内皮细胞后7天的免疫荧光染色结果图；图7A为本专利技术提供的去细胞皮瓣体内皮下包埋后7天HE染色结果图；图7B为本专利技术提供的去细胞皮瓣体内皮下包埋后28天HE染色结果图。具体实施方式为了更清楚地说明本专利技术，下面结合优选实施例对本专利技术做进一步的说明。本领域技术人员应当理解，下面所具体描述的内容是说明性的而非限制性的，不应以此限制本专利技术的保护范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。本专利技术提供的一种去细胞皮瓣的制备方法，包括如下步骤：取动脉的穿支皮瓣，依次灌注肝素溶液，TritonX－100溶液和SDS溶液；将灌注后的所述穿支皮瓣进行干燥处理、灭菌处理和无菌保存。在本专利技术中，动脉为腹壁浅动脉。腹壁浅动脉穿支皮瓣不带腹直肌及其前鞘，只含有皮肤、皮下脂肪和血管蒂，具有传统皮瓣的优点，又避免了并发症的发生。由于去细胞皮瓣是将正常皮瓣去除其内的细胞成分，故而保留全厚皮肤及皮下组织的细胞外基质结构，可以用于修补全厚皮肤及皮下组织缺损的创面。肝素溶液是为了去除组织内的血液，TritonX－100溶液及SDS溶液为去细胞试剂，无毒害作用。其中，灌注的速度为20－40mL/h，例如可以为，但不限于20mL/h，25mL/h，30mL/h，35mL/h或40mL/h。在一个优选的实施方式中，灌注的速度为30mL/h。在本专利技术中，肝素溶液为肝素PBS溶液。在本专利技术中，肝素PBS溶液的浓度为10－20U/mL，例如可以为，但不限于10U/mL，11U/mL，12U/mL，13U/mL，14U/mL，15U/mL，16U/mL，17U/mL，18U/mL，19U/mL或20U/mL。TritonX－100溶液的浓度为0.3％－2％W/V，例如可以为，但不限于0.3％W/V，0.5％W/V，0.8％W/V，1％W/V，1.2％W/V，1.5％W/V，1.8％W/V或2％W/V。SDS溶液的浓度为0.1％－1％W/V，例如可以为，但不限于0.1％W/V，0.2％W/V，0.3％W/V，0.4％W/V，0.5％W/V，0.6％W/V，0.7％W/V，0.8％W/V，0.9％W/V或1％W/V。在一个优选的实施方式中，肝素PBS溶液的浓度为15U/mL，TritonX－100溶液的浓度为1％W/V，SDS溶液的浓度为0.5％W/V。在本专利技术中，肝素PB本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种去细胞皮瓣的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括如下步骤：取动脉的穿支皮瓣，依次灌注肝素溶液，Triton X－100溶液和SDS溶液；将灌注后的所述穿支皮瓣进行干燥处理、灭菌处理和无菌保存。

【技术特征摘要】
1.一种去细胞皮瓣的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括如下步骤：取动脉的穿支皮瓣，依次灌注肝素溶液，TritonX－100溶液和SDS溶液；将灌注后的所述穿支皮瓣进行干燥处理、灭菌处理和无菌保存。2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述动脉为腹壁浅动脉。3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述灌注的速度为20－40mL/h。4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述肝素溶液为肝素PBS溶液，所述肝素PBS溶液的浓度为10－20U/mL，所述TritonX－100溶液的浓度为0.3％－2％W/V，所述SDS溶液的浓度为0.1％－1％W/V。5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述肝素PBS溶液的灌注时间为4...

【专利技术属性】
技术研发人员：梅劲，高伟阳，余雅玲，杨良慧，柴益民，魏鹏，陈川，周乐斌，
申请(专利权)人：浙江保尔曼生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：浙江,33