一种双层组织工程皮肤及其制备方法技术

本发明专利技术公开一种组织工程双层皮肤及其制备方法，组织工程双层皮肤是以成纤维细胞和表皮细胞作为种子细胞，以脱细胞羊膜作为生物支架，构建获得的组织工程双层皮肤，本发明专利技术的组织工程双层皮肤具有成本低、操作简便、来源广泛和易于贮存的优点，是一种移植效率高的皮肤替代物。本发明专利技术还提供一种组织工程双层皮肤的制备方法。

Double layer tissue engineering skin and preparation method thereof

The invention discloses a tissue engineered skin and its preparation method, tissue engineered skin with fibroblasts and epidermal cells as seed cells in acellular amniotic membrane as scaffold to construct tissue engineered skin, the invention of the double layer of skin tissue engineering has the advantages of low cost, simple operation, wide source and it is easy to store, is a kind of high efficiency transplantation skin substitute. The invention also provides a preparation method of tissue engineering double skin.

【技术实现步骤摘要】
一种双层组织工程皮肤及其制备方法
本专利技术涉及组织工程
，尤其涉及一种双层组织工程皮肤及其制备方法。
技术介绍
皮肤是人体最大的器官组织，是机体与外界环境接触的屏障，具有保护、分泌、代谢和感觉等重要的功能。但当皮肤由于遗传因素、烧烫伤、糖尿病等引起的创伤，可使机体屏障功能丧失，引起感染、水电解质失衡、免疫低下以及多脏器功能衰竭。最普通的方法是进行自身皮肤移植，但对于大面积的烧伤，自身正常皮肤来源有限而且移植后皮肤存活的几率低，倘若利用非已皮肤也会出现免疫排斥的问题。组织工程学是应用工程学和生命科学的原理与方法，构建生物性替代物，以恢复、维持或增进受损器官或组织功能的一门科学。先已商业化的皮肤产品有Dermagraft、Apligraft等，理想的组织工程皮肤应包含表皮与真皮两层，表皮与真皮无论在解剖上还是在功能上都是相互依存的整体。Dermagraft只具有真皮层的单层组织工程皮肤；Apligraft既含有表皮层又含有真皮层的组织工程化皮肤，但是所用支架胶原凝胶的收缩率较大，使用同种异体细胞和牛胶原，存在着不可预知的免疫排斥反应和潜在病毒感染的风险而且脆性大，操作困难。因此，制备一种取材方便，培养周期短，成本低，移植效率高的皮肤替代物是很有必要的。
技术实现思路
为了克服现有技术的不足，本专利技术提供一种组织工程皮肤，所用的种子细胞是由成纤维细胞和表皮细胞经过一系列的诱导而得到的，无需从病人自身获得，减轻了病人的痛苦，取材方便，而且以脱细胞羊膜为支架材料，具有成本低、操作简便、来源广泛和易于贮存的优点，是一种移植效率高的皮肤替代物。本专利技术还提供一种组织工程皮肤的制备方法，该制备方法取材方便，培养周期短，成本低。实现本专利技术的目的可以通过采取如下技术方案达到：一种组织工程双层皮肤，其是以成纤维细胞和表皮细胞作为种子细胞，以脱细胞羊膜作为生物支架，构建获得的组织工程双层皮肤。组织工程双层皮肤的制备方法，包括下列步骤：a、准备脱细胞羊膜、培养液和多能干细胞1)准备脱细胞羊膜1-1)选取已经脱离人体的胎盘，用无菌PBS冲洗，自羊膜与绒毛膜间的潜在空隙钝性剥离羊膜，前述取材均在无菌条件下完成；1-2)羊膜的脱脂处理：浸泡于氯仿和乙醇的混合液30min，其中，氯仿和乙醇的体积比为1:1；1-3)羊膜的去污处理：浸泡于稀释的TritonX-100中，常温去污处理5-7h；1-4)羊膜的脱细胞处理：用0.02％EDTA，在37℃下处理2h，然后用细胞刮片在显微镜下刮去上皮细胞；1-5)羊膜的灭菌处理：将羊膜放入含有抗菌药的PBS液浸20-30min；1-6)羊膜的保存处理：用无纺布作为羊膜的贴载物，-80℃保存于无菌甘油和DMEM的混和液中，混和液中无菌甘油和DMEM的体积比为1：1；1-7)羊膜在使用前浸泡在无菌生理盐水10-20min，使无纺布与羊膜分离开，之后羊膜用无菌PBS洗干净至无甘油，得到脱细胞羊膜备用；2)准备培养液2-1)配制培养液A：REGM培养基与MEF培养基以体积比为1：1的比例混合；2-2)配制培养液B：mTesR1培养基；2-3)配制500mL培养液C：1-5mmol/LL-谷酰胺、50-100ug/LbFGF、8-10mol/L地塞米松、DMEM基础培养基、FBS，其中DMEM基础培养基与FBS的体积比为9:1；2-4)配制500mL培养液D：450mLDMEM/F12培养基、50mLFBS、10-50ng/mLhEGF、1-6ng/mLHGF、1-4ng/mLbFGF、1-10ng/mLPDGF、1-10ng/mLIGF、2-10ng/mLTGF-β、DMEM/F12培养基、FBS，其中DMEM/F12培养基与FBS的体积比为9:1；2-5)配制500mL培养液E：450mLDMEM基础培养基、50mLFBS、10-40ug/LKGF、20-80ug/LTGF-β、6-15ug/LPDGF-AB、10-25ug/LVEGF、1-7ug/LIL-2、0.1-0.75ug/mL氢化可的松、MEM基础培养基、FBS，其中MEM基础培养基与FBS的体积比为9:1；2-6)配制500mL培养液F：450mL商品用DMEM/F12培养基、50mLFBS、0.1-1ng/mL氢化可的松、1×10-10mol/L霍乱毒素、0.01-0.1ng/mL胰岛素、1×10-7mol/L三碘甲状腺原氨酸、1.8×10-4mol/L腺嘌呤、100IU/mL青霉素、10-25ng/mLhEGF、5-15ug/mL转铁蛋白、1-10ug/mL谷氨酸、1-7μMY-27632、0.01-0.5mg/mL羧甲基壳聚糖、DMEM/F12培养基、FBS，其中，DMEM/F12培养基、FBS的体积比为9:1；2-7)配制500mL培养液G：5-15ug/LbFGF、0.05-2mmol/LVc、0.01-0.05mmol/mL非必需氨基酸、DMEM基础培养基、FBS，其中，DMEM基础培养基、FBS的体积比为9:1；2-8)配制500mL培养液H：1-5ng/mL胰岛素、0.1-0.5ug/mL氢化可的松、10-50ug/mL腺嘌呤、100-150ug/mLVc、1-10ng/mLhEGF、2-16ng/mLbFGF、10-45ug/mLBPE、1-25ug/mL转铁蛋白、0.1-1mg/mL羧甲基壳聚糖、DMEM/F12培养基、FBS，其中，DMEM/F12培养基、FBS的体积比为9:1；2-9)配制500mL培养液I：0.01-1μmol/L胰岛素、0.01-1mmol/mL非必需氨基酸、2-20ng/mLhEGF、100IU/mL青霉素、15-50ug/mLBPE、100-500μg/mL氯化钙、DMEM/F12培养基、FBS，其中，DMEM/F12培养基、FBS的体积比为9:1；3)准备多能干细胞3-1)收集尿液细胞在每个收集杯加2mL混有青霉素和链霉素的双抗，每个收集杯中收集一份尿液；为每份尿液准备六孔板中的一个孔，将该孔用质量浓度为0.1％明胶包被20min以上，使用前吸去孔内液体，得到包被孔；把尿液倒入离心管里，离心400g，10min；吸去上清液，每管留下1-5mL的余量，然后将每管中的余量混合到一个总离心管内；向该总离心管加入10-30mLPBS，轻轻混匀；然后离心400g，10min；再吸去上清液，剩余0.5-1mL液体；把剩余的液体加入包被孔中，再加入3mLREGM、3μLPrimocin；再将六孔板放置于37℃培养箱内培养，待尿液细胞贴壁后，吸去培养基，用PBS清洗，再进行换液处理；当尿液细胞中融合细胞的体积达到总细胞体积的80％，进行传代培养；3-2)尿液细胞经重编程生成诱导多能干细胞将表达转录调控因子OCT4、SOX2、NANOG、KLF4、LIN28中的一种或两种以上导入尿液细胞，将细胞分至预先用matrigel包被的六孔板中，用培养液A培养补至2mL；转染后第2天，将培养液更换为2mL培养液B，每天更换新鲜培养液B，使尿液细胞克隆继续增殖；转染后第7天，镜下观察形态与人胚胎干细胞相近的挑取单克隆，并接种于用matrigel包被的12孔板中，加1mL培养液B培养获得诱导多能干细胞，将生长稳定本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种组织工程双层皮肤，其特征在于，其是以成纤维细胞和表皮细胞作为种子细胞，以脱细胞羊膜作为生物支架，构建获得的组织工程双层皮肤。

【技术特征摘要】
1.一种组织工程双层皮肤，其特征在于，其是以成纤维细胞和表皮细胞作为种子细胞，以脱细胞羊膜作为生物支架，构建获得的组织工程双层皮肤。2.根据权利要求1所述的组织工程双层皮肤的制备方法，其特征在于，包括下列步骤：a、准备脱细胞羊膜、培养液和多能干细胞1)准备脱细胞羊膜1-1)选取已经脱离人体的胎盘，用无菌PBS冲洗，自羊膜与绒毛膜间的潜在空隙钝性剥离羊膜，前述取材均在无菌条件下完成；1-2)羊膜的脱脂处理：浸泡于氯仿和乙醇的混合液30min，其中，氯仿和乙醇的体积比为1:1；1-3)羊膜的去污处理：浸泡于稀释的TritonX-100中，常温去污处理5-7h；1-4)羊膜的脱细胞处理：用0.02％EDTA，在37℃下处理2h，然后用细胞刮片在显微镜下刮去上皮细胞；1-5)羊膜的灭菌处理：将羊膜放入含有抗菌药的PBS液浸20-30min；1-6)羊膜的保存处理：用无纺布作为羊膜的贴载物，-80℃保存于无菌甘油和DMEM的混和液中，混和液中无菌甘油和DMEM的体积比为1：1；1-7)羊膜在使用前浸泡在无菌生理盐水10-20min，使无纺布与羊膜分离开，之后羊膜用无菌PBS洗干净至无甘油，得到脱细胞羊膜备用；2)准备培养液2-1)配制培养液A：REGM培养基与MEF培养基以体积比为1：1的比例混合；2-2)配制培养液B：mTesR1培养基；2-3)配制500mL培养液C：1-5mmol/LL-谷酰胺、50-100ug/LbFGF、8-10mol/L地塞米松、DMEM基础培养基、FBS，其中DMEM基础培养基与FBS的体积比为9:1；2-4)配制500mL培养液D：450mLDMEM/F12培养基、50mLFBS、10-50ng/mLhEGF、1-6ng/mLHGF、1-4ng/mLbFGF、1-10ng/mLPDGF、1-10ng/mLIGF、2-10ng/mLTGF-β、DMEM/F12培养基、FBS，其中DMEM/F12培养基与FBS的体积比为9:1；2-5)配制500mL培养液E：450mLDMEM基础培养基、50mLFBS、10-40ug/LKGF、20-80ug/LTGF-β、6-15ug/LPDGF-AB、10-25ug/LVEGF、1-7ug/LIL-2、0.1-0.75ug/mL氢化可的松、MEM基础培养基、FBS，其中MEM基础培养基与FBS的体积比为9:1；2-6)配制500mL培养液F：450mL商品用DMEM/F12培养基、50mLFBS、0.1-1ng/mL氢化可的松、1×10-10mol/L霍乱毒素、0.01-0.1ng/mL胰岛素、1×10-7mol/L三碘甲状腺原氨酸、1.8×10-4mol/L腺嘌呤、100IU/mL青霉素、10-25ng/mLhEGF、5-15ug/mL转铁蛋白、1-10ug/mL谷氨酸、1-7μMY-27632、0.01-0.5mg/mL羧甲基壳聚糖、DMEM/F12培养基、FBS，其中，DMEM/F12培养基、FBS的体积比为9:1；2-7)配制500mL培养液G：5-15ug/LbFGF、0.05-2mmol/LVc、0.01-0.05mmol/mL非必需氨基酸、DMEM基础培养基、FBS，其中，DMEM基础培养基、FBS的体积比为9:1；2-8)配制500mL培养液H：1-5ng/mL胰岛素、0.1-0.5ug/mL氢化可的松、10-50ug/mL腺嘌呤、100-150ug/mLVc、1-10ng/mLhEGF、2-16ng/mLbFGF、10-45ug/mLBPE、1-25ug/mL转铁蛋白、0.1-1mg/mL羧甲基壳聚糖、DMEM/F12培养基、FBS，其中，DMEM/F12培养基、FBS的体积比为9:1；2-9)配制500mL培养液I：0.01-1μmol/L胰岛素、0.01-1mmol/mL非必需氨基酸、2-20ng/mLhEGF、100IU/mL青霉素、15-50ug/mLBPE、100-500μg/mL氯化钙、DMEM/F12培养基、FBS，其中，DMEM/F12培养基、FBS的体积比为9:1；3)准备多能干细胞3-1)收集尿液细胞在每个收集杯加2mL混有青霉素和链霉素的双抗，每个收集杯中收集一份尿液；为每份尿液准备六孔板中的一个孔，将该孔用质量浓度为0.1％明胶包被20min以上，使用前吸去孔内液体，得到包被孔；把尿液倒入离心管里，离心400g，10min；吸去上清液，每管留下1-5mL的余量，然后将每管中的余量混合到一个总离心管内；向该总离心管加入10-30mLPBS，轻轻混匀；然后离心400g，10min；再吸去上清液，剩余0.5-1mL液体；把剩余的液体加入包被孔中，再加入3mLREGM、3μLPrimocin；再将六孔板放置于37℃培养箱内培养，待尿液细胞贴壁后，吸去培养基，用PBS清洗，再进行换液处理；当尿液细胞中融合细胞的体积达到总细胞体积的80％，进行传代培养；3-2)尿液细胞经重编程生成诱导多能干细胞将表达转录调控因子OCT4、SOX2、NANOG、KLF4、LIN28中的一种或两种以上导入尿液细胞，将细胞分至预先用matrigel...

【专利技术属性】
技术研发人员：黄燕飞，车七石，冼钢，钟经德，
申请(专利权)人：广州润虹医药科技有限公司，
类型：发明
国别省市：广东,44