一种含附属器的组织工程皮肤及其制备方法技术

本发明专利技术属于生物技术领域，具体涉及到一种含附属器的组织工程皮肤及其制备方法，本发明专利技术通过尿液细胞转染诱导产生多能干细胞，继续诱导产生充质干细胞，由充质干细胞分化形成表皮细胞、成纤维细胞和毛囊细胞，与生物支架材料羊膜构建含有附属器的组织工程双层皮肤，本发明专利技术制备的组织工程皮肤种子细胞为尿液细胞获取方便，培养周期短，含有的毛囊结构有利于创面的愈合，并且本发明专利技术为后续开发含有附属器组织工程皮肤奠定了基础。

【技术实现步骤摘要】
一种含附属器的组织工程皮肤及其制备方法
本专利技术属于生物
，具体涉及到一种含附属器的组织工程皮肤及其制备方法。
技术介绍
皮肤作为人体最大的组织器官，是人体的第一道防护屏障，它可以防止体内水份、电解质的丢失，同时也保护机体不受外界有害物质的侵害，皮肤容易受到外伤、烧伤、炎症、溃疡、肿瘤术后及先天疾病等因素的损害。组织工程皮肤的出现为创面修复领域研究提供了一种新的治疗途径。目前国内外市场已有很多种皮肤替代物，一种只具有真皮层的单层组织工程皮肤，这种皮肤替代物隔离外界细菌能力差，容易引起感染；另一种为双层组织工程皮肤，既含有表皮层又含有真皮层的组织工程化皮肤，这种皮肤替代物虽然效果较好，但是细胞生长及保存条件苛刻，使其成本高昂，保质期短，而且所用支架胶原凝胶的收缩率较大，使用同种异体细胞和牛胶原，存在着不可预知的免疫排斥反应和潜在病毒感染的风险而且脆性大，操作困难。就对于目前的技术方法并不能在组织工程皮肤中构建出皮肤的附属器结构，如毛囊、汗腺、皮脂腺等。这些结构在皮肤创伤修复和重建过程中又起着至关重要的作用。因此，本专利技术对于含有毛囊附属器的组织工程皮肤的构建对于后续研发含有附属器的组织工程皮肤奠定了基础。公告号为CN101773688B的中国专利公开了一种含附属器的组织工程皮肤的制备方法，是在凝胶溶液中接种羊膜间充质干细胞、向毛乳头方向诱导的羊膜间充质干细胞、羊膜上皮细胞、向汗腺上皮方向诱导的羊膜上皮细胞，经真皮层培养后，再经形成毛囊、汗腺结构的诱导培养，于其表面再接种羊膜上皮细胞和经向角质形成细胞诱导的羊膜上皮细胞，培养后得到具有毛囊、汗腺结构的组织工程皮肤，该专利技术使用的培养基80％体积分数来源于动物细胞外基质，成分复杂，容易传播疾病，容易发生排斥反应。公告号为CN105056307A的中国专利公开了一种人造皮肤及其制备方法，该人造皮肤包括表皮细胞、真皮细胞和生物支架材料；其是将所述真皮细胞复合于所述生物支架材料内部，在表面接种所述表皮细胞，培养制备获得的。该人造皮肤具有真皮层和表皮层，带有活性细胞，且表皮层中含有角质层，接近于正常皮肤，但是该专利技术所述的生物支架材料是胶原蛋白、细胞外基质复合物、透明质酸、多糖、硫酸软骨素、聚乳酸、聚羟基乙酸、聚乳酸和聚羟基乙酸的共聚物中的一种或两者以上混合物。
技术实现思路
为了解决现有技术的不足，本专利技术提供了一种含附属器的组织工程皮肤及其制备方法，使用尿液细胞为种子细胞，获取方便，培养周期短，含有的毛囊结构有利于创面的愈合，并且本专利技术为后续开发含有附属器组织工程皮肤奠定了基础。本专利技术技术方案如下所示：一种含附属器的组织工程皮肤的制备方法，步骤为：步骤一：尿液细胞的收集1)收集杯中加入2mL青霉素/链霉素双抗后，收集90-150mL尿液；2)将尿液倒入3-5个50mL离心管中，离心400r/min，10min，吸去上清液至每管剩余液体1-5mL，合并到一个离心管内，加入10-30mL含有体积分数为5％青霉素/链霉素的PBS中，混匀后，离心400r/min，10min，吸去上清液至剩余液体0.5-1ml；3)将六孔板1孔用0.1％明胶包被20min-30min后，吸去孔内液体，将步骤2)得到的剩余液体倒入包被好的孔中，加入2mLREGM培养基再加入3μLPrimocin后，放入37℃培养箱内培养，待尿液中细胞贴壁后，进行换液处理；4)当尿液细胞融合度达到80％，则可进行传代培养；步骤二：多能干细胞的诱导与培养①细胞转染：将表达转录调控因子OCT4、SOX2、NANOG、KLF4和LIN28导入尿液细胞，然后分至预先用matrigel包被的6孔板中，用培养液B补至每孔2mL培养，细胞培养密度为1×106/ml；②细胞增殖：细胞转染第2天，将培养基B更换为mTesR1培养基，并且连续7天每天更换mTesR1培养基，得到克隆细胞；③细胞优化：镜下观察并挑选形态与人胚胎干细胞相近的克隆细胞，作为多能干细胞，并接种于用matrigel包被的12孔板中，细胞接种密度为1×106/ml，每孔加1mLmTesR1培养基进行传代培养；步骤三：间充质干细胞的诱导与培养(1)当诱导多能干细胞长至80％时，将mTesR1培养基去除，加1mLDMEM/F12培养液清洗一遍后，加含0.5mMEDTA的DPBS消化5min，400r/min，离心5min，收集细胞沉淀，加入mTesR1培养基以1：3的比例进行传代，传至已被Matrigel包被好的六孔板中；(2)待多能干细胞长至六孔板的70％-80％时，PBS冲洗一遍后，更换培养基D，培养2天后，得到间充质干细胞，加含0.5mMEDTA的DPBS进行消化，400r/min，离心5min，加入培养基E重悬细胞，制成1×106/ml单细胞悬液；(3)将单细胞悬液接种至0.1％明胶预先包被的10ml细胞培养皿中，当细胞融合度达到90％后，加含0.5mMEDTA的DPBS消化细胞，然后加入培养基E按照1：3的比例进行细胞传代培养；步骤四：(一)组织工程表皮细胞的培养<1>将间充质干细胞培养基中的培养基E去除，加1mLDMEM/F12培养液清洗一遍后，加含0.5mMEDTA的DPBS消化5min，400r/min，离心5min，收集细胞沉淀，加入培养基E以1：3的比例进行传代，传至已被Matrigel包被好的六孔板中；<2>待间充质干细胞长至六孔板的70％-80％时，PBS冲洗一遍后，更换培养基F，每两天更换一次培养基，培养4天后，得到表皮细胞，加含0.5mMEDTA的DPBS进行消化，400r/min，离心5min，加入培养基G重悬细胞，制成1×106/ml单细胞悬液；<3>将单细胞悬液接种至10cm细胞培养皿中，细胞融合度达到90％后，加含0.5mMEDTA的DPBS消化，使用培养基G重悬细胞，制成1×106/ml单细胞悬液，备用；(二)组织工程成纤维细胞的培养[1]同步骤四(一)中的<1>；[2]待间充质干细胞长至六孔板的70％-80％时，PBS冲洗一遍后，更换培养基H，每两天更换一次培养基，培养5天后，得到成纤维细胞，加含0.5mMEDTA的DPBS进行消化，400r/min，离心5min，加入培养基I重悬细胞，制成5×105/ml单细胞悬液；[3]将单细胞悬液接种至10cm细胞培养皿中，细胞生长3天融合度达到90％后，加含0.5mMEDTA的DPBS消化，使用培养基I重悬细胞，制成5×105单细胞悬液，备用；(三)组织工程毛囊细胞的诱导培养{1}同步骤四(一)中的<1>；{2}待间充质干细胞长至六孔板的70％-80％时，PBS冲洗一遍后，更换培养基J，每两天更换一次培养基，培养5天后，得到毛囊细胞，加含0.5mMEDTA的DPBS进行消化，400r/min，离心5min，加入培养基K重悬细胞，制成5×105/ml单细胞悬液；{3}将单细胞悬液接种至10cm细胞培养皿中，细胞生长3天融合度达到90％后，加含0.5mMEDTA的DPBS消化，使用培养基K重悬细胞，制成5×105单细胞悬液，备用；步骤五：含有附属器的组织工程双层皮肤的构建<I>将羊膜打孔成与6板孔直径相同的本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种含附属器的组织工程皮肤的制备方法，其特征在于，步骤为：步骤一：尿液细胞的收集1)收集杯中加入2mL青霉素/链霉素双抗后，收集90‑150mL尿液；2)将尿液倒入3‑5个50mL离心管中，离心400r/min，10min，吸去上清液至每管剩余液体1‑5mL，合并到一个离心管内，加入10‑30mL含有体积分数为5％青霉素/链霉素的PBS中，混匀后，离心400r/min，10min，吸去上清液至剩余液体0.5‑1ml；3)将六孔板1孔用0.1％明胶包被20min‑30min后，吸去孔内液体，将步骤2)得到的剩余液体倒入包被好的孔中，加入2mLREGM培养基再加入3μL Primocin后，放入37℃培养箱内培养，待尿液中细胞贴壁后，进行换液处理；4)当尿液细胞融合度达到80％，则可进行传代培养；步骤二：多能干细胞的诱导与培养①细胞转染：将表达转录调控因子OCT4、SOX2、NANOG、KLF4和LIN28导入尿液细胞，然后分至预先用matrigel包被的6孔板中，用培养液B补至每孔2mL培养，细胞培养密度为1×10

【技术特征摘要】
1.一种含附属器的组织工程皮肤的制备方法，其特征在于，步骤为：步骤一：尿液细胞的收集1)收集杯中加入2mL青霉素/链霉素双抗后，收集90-150mL尿液；2)将尿液倒入3-5个50mL离心管中，离心400r/min，10min，吸去上清液至每管剩余液体1-5mL，合并到一个离心管内，加入10-30mL含有体积分数为5％青霉素/链霉素的PBS中，混匀后，离心400r/min，10min，吸去上清液至剩余液体0.5-1ml；3)将六孔板1孔用0.1％明胶包被20min-30min后，吸去孔内液体，将步骤2)得到的剩余液体倒入包被好的孔中，加入2mLREGM培养基再加入3μLPrimocin后，放入37℃培养箱内培养，待尿液中细胞贴壁后，进行换液处理；4)当尿液细胞融合度达到80％，则可进行传代培养；步骤二：多能干细胞的诱导与培养①细胞转染：将表达转录调控因子OCT4、SOX2、NANOG、KLF4和LIN28导入尿液细胞，然后分至预先用matrigel包被的6孔板中，用培养液B补至每孔2mL培养，细胞培养密度为1×106/ml；②细胞增殖：细胞转染第2天，将培养基B更换为mTesR1培养基，并且连续7天每天更换mTesR1培养基，得到克隆细胞；③细胞优化：镜下观察并挑选形态与人胚胎干细胞相近的克隆细胞，作为多能干细胞，并接种于用matrigel包被的12孔板中，细胞接种密度为1×106/ml，每孔加1mLmTesR1培养基进行传代培养；步骤三：间充质干细胞的诱导与培养(1)当诱导多能干细胞长至80％时，将mTesR1培养基去除，加1mLDMEM/F12培养液清洗一遍后，加含0.5mMEDTA的DPBS消化5min，400r/min，离心5min，收集细胞沉淀，加入mTesR1培养基以1：3的比例进行传代，传至已被Matrigel包被好的六孔板中；(2)待多能干细胞长至六孔板的70％-80％时，PBS冲洗一遍后，更换培养基D，培养2天后，得到间充质干细胞，加含0.5mMEDTA的DPBS进行消化，400r/min，离心5min，加入培养基E重悬细胞，制成1×106/ml单细胞悬液；(3)将单细胞悬液接种至0.1％明胶预先包被的10ml细胞培养皿中，当细胞融合度达到90％后，加含0.5mMEDTA的DPBS消化细胞，然后加入培养基E按照1：3的比例进行细胞传代培养；步骤四：(一)组织工程表皮细胞的培养<1>将间充质干细胞培养基中的培养基E去除，加1mLDMEM/F12培养液清洗一遍后，加含0.5mMEDTA的DPBS消化5min，400r/min，离心5min，收集细胞沉淀，加入培养基E以1：3的比例进行传代，传至已被Matrigel包被好的六孔板中；<2>待间充质干细胞长至六孔板的70％-80％时，PBS冲洗一遍后，更换培养基F，每两天更换一次培养基，培养4天后，得到表皮细胞，加含0.5mMEDTA的DPBS进行消化，400r/min，离心5min，加入培养基G重悬细胞，制成1×106/ml单细胞悬液；<3>将单细胞悬液接种至10cm细胞培养皿中，细胞融合度达到90％后，加含0.5mMEDTA的DPBS消化，使用培养基G重悬细胞，制成1×106/ml单细胞悬液，备用；(二)组织工程成纤维细胞的培养[1]同步骤四(一)中的<1>；[2]待间充质干细胞长至六孔板的70％-80％时，PBS冲洗一遍后，更换培养基H，每两天更换一次培养基，培养5天后，得到成纤维细胞，加含0.5mMEDTA的DPBS进行消化，400r/min，离心5min，加入培养基I重悬细胞，制成5×105/ml单细胞悬液；[3]将单细胞悬液接种至10cm细胞培养皿中，细胞生长3天融合度达到90％后，加含0.5mMEDTA的DPBS消化，使用培养基I重悬细胞，制成5×105单细胞悬液，备用；(三)组织工程毛囊细胞的诱导培养{1}同步骤四(一)中的<1>；{2}待间充质干细胞长至六孔板的70％-80％时，PBS冲洗一遍后，更换培养基J，每两天更换一次培养基，培养5天后，得到毛囊细胞，加含0.5mMEDTA的DPBS进行消化，400r/min，离心5min，加入培养基K重悬细胞，制成5...

【专利技术属性】
技术研发人员：车七石，
申请(专利权)人：广州润虹医药科技有限公司，
类型：发明
国别省市：广东,44