可悬浮培养的牛肾细胞在病毒培养及疫苗生产的应用制造技术

本发明专利技术公开了可悬浮培养的牛肾细胞在病毒培养和疫苗制备中的应用。本发明专利技术牛肾细胞MDBK悬浮培养方法省去了细胞消化、换液、频繁分种等大量人工操作，培养方法简便、快速，而且采用反应器培养实现了工艺自动化，不仅提高了单位体积的细胞产量，还解决了传统贴壁培养细胞批间存在差异的技术难题。

Culture of bovine kidney cells by suspension culture and its application in virus culture and vaccine production

The present invention discloses the application of bovine kidney cells capable of suspension culture in virus culture and vaccine preparation. The invention of bovine kidney MDBK cell suspension culture method without cell digestion, liquid exchange, frequent minutes etc. a large number of manual operations, training method is simple and rapid, and the reactor culture realizes process automation, not only improves the unit volume of the cell yield, but also solves the technical problems of traditional adherent cell number of the differences between.

【技术实现步骤摘要】
可悬浮培养的牛肾细胞在病毒培养及疫苗生产的应用
本专利技术属于细胞工程
，特别是涉及可悬浮培养的牛肾细胞(MDBK)悬浮培养后在病毒培养及疫苗生产方面的应用。
技术介绍
牛肾细胞(MDBK)传代细胞系来自公牛肾细胞，可用于病毒培养、原材料检验、营养代谢研究。MDBK通常可采用克氏瓶、转瓶甚至反应器载体培养，但实质均未改变，细胞均为贴壁培养工艺，贴壁培养工艺培养批量较小、批间差异大、生产效率低下、劳动强度大、占用场地多，细胞单位产量低，大规模生产工艺复杂。牛病毒性腹泻/粘膜、牛传染性鼻气管炎、伪狂犬等病毒培养或疫苗生产通常采用MDBK贴壁细胞静置培养或转瓶培养的方法进行扩增，但存在贴壁培养工艺放大繁琐、培养批量较小、批间差异大、生产效率低下、劳动强度大、占用场地多等诸多问题，细胞单位产量低，大规模生产工艺复杂。CN104162154A中提出利用悬浮培养技术生产牛病毒性腹泻、牛传染性鼻气管炎二联灭活疫苗，其使用经过驯化的MDBK细胞并未形成能够稳定传代的悬浮细胞株，由于细胞悬浮驯化存在不确定因素，并不是每次都能成功复制，在生产应用中存在较大困难。
技术实现思路
本专利技术的目的在于利用悬浮培养的牛肾细胞MDBK进行各类敏感病毒的培养和疫苗生产，以解决现有技术中利用贴壁细胞进行病毒培养和疫苗生产中存在的问题。本专利技术可悬浮培养的牛肾细胞在病毒培养及疫苗生产的应用，所述可悬浮培养的牛肾细胞MDBK，具有以下特征：1)细胞直径：14-25μm；2)核型：2n＝60；3)可在不依赖附着物条件下纯悬浮培养，悬浮液中细胞密度≥1.0-2.0×106细胞/mL；4)使用无血清或低血清培养基培养；5)可使用生物反应器大规模培养；所述病毒为伪狂犬病毒、牛病毒性腹泻/粘膜病毒、牛传染性鼻气管炎病毒、羊口疮病毒、牛呼吸道合胞体病毒、牛副流感3型病毒等；所述疫苗为灭活疫苗或弱毒活疫苗。具体的，所述可悬浮培养的牛肾细胞为MDBK-SCGMCCNo.11795细胞株经过悬浮培养获得的细胞。以上所述应用中，可悬浮培养的牛肾细胞MDBK，是用牛肾细胞专用悬浮培养基将牛肾细胞MDBK种细胞悬液稀释至密度为0.3-0.5×106细胞/mL，然后接种至反应器中，加入所述牛肾细胞专用悬浮培养基，在温度37℃、溶氧40-60％(饱和度百分比)、pH值7.0-7.2、转速40-60rpm条件下培养48-72小时至反应器内的牛肾细胞MDBK密度达到1.0×106-4.0×106细胞/mL；所述牛肾细胞专用悬浮培养基为含1％-5％(体积百分比V/V)新生牛血清的低血清培养基或无血清培养基；优选牛肾细胞专用悬浮培养基为含有CD培养基粉末15-20g/L、碳酸氢钠2-3g/L的水溶液，pH值7.0-7.2；优选牛肾细胞专用悬浮培养基中含使用注射用水溶解的CD培养基粉末17.7g/L，再加入碳酸氢钠至2.32g/L，调节pH值至7.0-7.2。以上所述应用中，病毒培养方法包括以下步骤：1)种毒培养与制备取生长良好的MDBK贴壁细胞，待细胞长满单层后弃去原培养液，更换含有1％-10％(体积比)所述病毒的维持液(DMEM培养基)，在36℃-37℃培养，待细胞CPE达到75％-85％以上时，收获病毒液作为种毒，保存备用；2)悬浮毒液制备取经生物反应器培养的权利要求1中所述悬浮培养的牛肾细胞MDBK或权利要求2中所述MDBK-SCGMCCNo.11795悬浮细胞，弃去原培养液，加入无血清或含0.5-2％(体积比)血清的SFM培养基恢复至原体积，按体积比加入0.1-10％步骤1)的种毒，在病毒适宜培养条件下培养48h-96h，待细胞活力低于15％-30％时收获病毒液。具体的，所述病毒为伪狂犬病毒，种毒加入量为体积比1％，在温度36-37℃、溶氧40-60％(饱和度百分比)、pH值6.8-7.2、转速40-60rpm下培养72h-96h至细胞活力低于30％时收获得到悬浮培养的伪狂犬病毒液；具体的，所述病毒为羊接触传染性脓疱性皮炎病毒，种毒加入量为体积比1-2％，在温度36-37℃、溶氧40-60％(饱和度百分比)、pH值7.4±0.1、转速40-60rpm下培养48h-72h至细胞活力低于15％时收获得到悬浮培养的羊接触传染性脓疱性皮炎病毒液；具体的，所述病毒为牛病毒性腹泻/粘膜病毒，种毒加入量为体积比0.1-10％，在温度36-37℃、溶氧40-60％(饱和度百分比)、pH值7.2-7.4、转速40-60rpm下培养72-96h至细胞活力低于30％时收获得到悬浮培养的牛病毒性腹泻/粘膜病毒液；具体的，所述病毒为牛传染性鼻气管炎病毒，种毒加入量为体积比0.1-1％，在温度36-37℃、溶氧40-60％(饱和度百分比)、pH值7.2-7.4、转速40-60rpm下培养48-72h至细胞活力低于20％时收获得到悬浮培养的牛传染性鼻气管炎病毒液；具体的，所述病毒为牛呼吸道合胞体病毒，种毒加入量为体积比1-5％，在温度37℃、溶氧40-60％(饱和度百分比)、pH值7.2-7.4、转速40-60rpm下培养56h-72h至细胞活力低于15％时收获得到悬浮培养的牛呼吸道合胞体病毒液；具体的，所述病毒为牛副流感3型病毒，种毒加入量为体积比0.1-1％，在温度37℃、溶氧40-60％(饱和度百分比)、pH值7.2-7.4、转速40-60rpm下培养48-72h至细胞活力低于20％时收获得到悬浮培养的牛副流感3型病毒液。以上所述应用中，灭活疫苗的制备方法包括以下步骤：(1)毒液灭活将以上得到的悬浮培养的病毒液去除细胞碎片，按体积0.025％加入灭活剂，4℃灭活24小时，升温至37℃保持2小时，将灭活后毒液保存备用；所述灭活剂为β-丙内酯、二乙烯亚胺或甲醛；(2)配苗取经灭活后的病毒液，按体积比46:54加入206佐剂(SEPPIC)混合制成灭活疫苗。具体的，所述毒液为悬浮培养的伪狂犬病毒液，按体积比46:54加入206佐剂(SEPPIC)，得到针对伪狂犬病的灭活疫苗；具体的，所述毒液为悬浮培养的羊接触传染性脓疱性皮炎病毒液，按体积比46:54加入206佐剂(SEPPIC)，得到针对羊接触传染性脓疱性皮炎的灭活疫苗；具体的，所述毒液为悬浮培养的牛病毒性腹泻/粘膜病毒液，按体积比46:54加入206佐剂(SEPPIC)，得到针对牛病毒性腹泻/粘膜病的灭活疫苗；具体的，所述毒液为悬浮培养的牛传染性鼻气管炎病毒液，按体积比46:54加入206佐剂(SEPPIC)，得到针对牛传染性鼻气管炎病的灭活疫苗；具体的，所述毒液为悬浮培养的牛呼吸道合胞体病毒液，按体积比46:54加入206佐剂(SEPPIC)，得到针对牛呼吸道合胞体病的灭活疫苗；具体的，所述毒液为悬浮培养的牛副流感3型病毒液，按体积比46:54加入206佐剂(SEPPIC)，得到针对牛副流感3型病的灭活疫苗。以上所述应用中，弱毒活疫苗的制备过程为：将悬浮培养的弱毒病毒液按体积比1:1-2加入保护剂，经真空冷冻干燥制成病毒活疫苗；所述保护剂为蔗糖牛奶保护剂或耐热保护剂。具体的，所述毒液为悬浮培养的伪狂犬病毒液，保护剂为蔗糖牛奶保护剂，病毒液与保护剂体积比为1:1-2蔗糖牛奶，得到针对伪狂犬病的弱毒活疫苗；具体的，所述毒液为悬浮培养的羊本文档来自技高网...

【技术保护点】
可悬浮培养的牛肾细胞在病毒培养及疫苗生产的应用，所述可悬浮培养的牛肾细胞MDBK，具有以下特征：1)细胞直径：14‑25μm；2)核型：2n＝60；3)可在不依赖附着物条件下纯悬浮培养，悬浮液中细胞密度≥1.0‑2.0×10

【技术特征摘要】
2016.03.16 CN 20161015467121.可悬浮培养的牛肾细胞在病毒培养及疫苗生产的应用，所述可悬浮培养的牛肾细胞MDBK，具有以下特征：1)细胞直径：14-25μm；2)核型：2n＝60；3)可在不依赖附着物条件下纯悬浮培养，悬浮液中细胞密度≥1.0-2.0×106细胞/mL；4)使用无血清或低血清培养基培养；或/和5)可使用生物反应器大规模培养；所述病毒为伪狂犬病毒、牛病毒性腹泻/粘膜病毒、牛传染性鼻气管炎病毒、羊口疮病毒、牛呼吸道合胞体病毒、牛副流感3型病毒等；所述疫苗为灭活疫苗或弱毒活疫苗。2.根据权利要求1所述应用，所述可悬浮培养的牛肾细胞为MDBK-SCGMCCNo.11795细胞株经过悬浮培养获得的细胞。3.根据权利要求1或2所述应用，可悬浮培养的牛肾细胞MDBK，是用牛肾细胞专用悬浮培养基将牛肾细胞MDBK种细胞悬液稀释至密度为0.3-0.5×106细胞/mL，然后接种至反应器中，加入所述牛肾细胞专用悬浮培养基，在温度37℃、溶氧40-60％(饱和度百分比)、pH值7.0-7.2、转速40-60rpm条件下培养48-72小时至反应器内的牛肾细胞MDBK密度达到1.0×106-4.0×106细胞/mL；所述牛肾细胞专用悬浮培养基为含1％-5％(体积百分比V/V)新生牛血清的CD培养基(低血清培养基)或CD培养基(无血清培养基)；优选牛肾细胞专用悬浮培养基为含有CD培养基粉末15-20g/L、碳酸氢钠2-3g/L的水溶液，pH值7.0-7.2；优选牛肾细胞专用悬浮培养基中含使用注射用水溶解的CD培养基粉末17.7g/L，再加入碳酸氢钠至2.32g/L，调节pH值至7.0-7.2。4.根据权利要求1或2或3所述应用，所述病毒培养方法包括以下步骤：1)种毒培养与制备取生长良好的MDBK贴壁细胞，待细胞长满单层后弃去原培养液，更换含有1％-10％(体积比)所述病毒的维持液(DMEM培养基)，在36℃-37℃培养，待细胞CPE达到75％-85％以上时，收获病毒液作为种毒，保存备用；2)悬浮毒液制备取经生物反应器培养的权利要求1中所述悬浮培养的牛肾细胞MDBK或权利要求2中所述MDBK-SCGMCCNo.11795悬浮细胞，弃去原培养液，加入无血清或含0.5-2％(体积比)血清的SFM培养基恢复至原体积，按体积比加入0.1-10％步骤1)的种毒，在病毒适宜培养条件下培养48h-96h，待细胞活力低于15％-30％时收获病毒液。5.根据权利要求4所述应用，所述病毒为以下任一种，培养条件分别为：所述病毒为伪狂犬病毒，种毒加入量为体积比1％，在温度36-37℃、溶氧40-60％(饱和度百分比)、pH值6.8-7.2、转速40-60rpm下培养72h-96h至细胞活力低于30％时收获得到悬浮培养的伪狂犬病毒液；所述病毒为羊接触传染性脓疱性皮炎病毒，种毒加入量为体积比1-2％，在温度36-37℃、溶氧40-60％(饱和度百分比)、pH值7.4±0.1、转速40-60rpm下培养48h-72h至细胞活力低于15％时收获得到悬浮培养的羊接触传染性脓疱性皮炎病毒液；所述病毒为牛病毒性腹泻/粘膜病毒，种毒加入量为体积比0.1-10％，在温度36-37℃、溶氧40-60％(饱和度百分比)、pH值7.2-7.4、转速40-60rpm下培养72-96h至细胞活力低于30％时收获得到悬浮培养的牛病毒性...

【专利技术属性】
技术研发人员：郝鹏，刘国英，温谢，张燕红，羡东堡，杨波，孔彩平，田志辉，路荣，李超，宋志刚，范秀丽，张贵刚，
申请(专利权)人：金宇保灵生物药品有限公司，
类型：发明
国别省市：内蒙古,15