本发明专利技术提供一种悬浮培养敏感细胞的方法，其包括如下步骤：(1)利用包含能减弱细胞粘附性能基因序列的表达载体稳定转染Marc145细胞或MA104细胞；(2)筛选并分离稳定转染细胞克隆；(3)检测稳定转染细胞克隆中的基因表达；(4)稳定转染细胞克隆的悬浮培养。本发明专利技术进一步涉及利用所述悬浮培养的Marc145细胞或MA104细胞生产蓝耳病疫苗的方法。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及医药生物领域，具体涉及悬浮培养敏感细胞的方法，所述敏感细胞包括Marcl45细胞或MA104细胞；进一步涉及利用该细胞生产蓝耳病疫苗的方法。
技术介绍
体外细胞的培养方法包括贴壁培养和悬浮培养，其中悬浮培养又可分为微载体悬浮培养及全悬浮培养。与贴壁培养相比，悬浮培养具有如下优点(1)可连续扩大生产量；有利于细胞培养基中的营养物质和气体充分接触，而且易于控制培养条件(温度、pH、 氧分压和CO2等)；C3)培养条件稳定，趋于均一，便于进行定量研究；(4)易于在连续密闭的系统中进行，减少了操作步骤和污染的机会；(5)可以长期连续培养，既可节省人力，又使细胞能持续维持在对数生长期；(6)悬浮培养的细胞仍保持原先对病毒的敏感性和生物学特性。而与微载体悬浮培养相比，全悬浮培养有以下优势无需昂贵的微载体，从而有效降低生产成本；可省去微载体培养中附加步骤如消化收获细胞等，从而简化生产过程，缩短生产时间，提高生产效率，并易于进行扩大培养。现有研究已发现影响细胞粘附的一些基因。例如人类siat7e基因被认为在控制细胞贴附程度中起着一定的作用，增加的siat7e基因的表达可减少细胞粘附 (Jaluria P，Betenbaugh M,Konstantopoulos K，Frank B，Shiloach J(2007)Application of microarrays to identify and characterize genes involved in attachment dependence in HeLa cells. Metab Eng 9:241-251·)。蓝耳病，是猪繁殖与呼吸综合征病毒(也可称蓝耳病病毒)感染所引起的一种接触性传染病。各种日龄的猪只均可感染，临床上主要表现为母猪繁殖障碍和仔猪的呼吸症状。母猪的繁殖障碍可表现为流产、死产和弱仔，生后仔猪的死淘率增加；哺乳仔猪的呼吸道症状主要表现为高热、呼吸困难等肺炎的症状。该病目前尚无特效药物疗法，主要采取疫苗强制免疫的办法。Marcl45细胞为上皮样细胞，其来源于猴肾细胞，从母细胞(MA104细胞)克隆而得至IJ，可连续传代培养。Marcl45细胞及MA104细胞对蓝耳病病毒均较为敏感，目前，蓝耳病疫苗的生产主要是通过转瓶贴壁培养或生物反应器微载体悬浮培养Marcl45细胞的工艺进行生产，还未能实现细胞全悬浮培养，在生产成本、生产效率以及满足市场需求方面都具有较大局限性。
技术实现思路
本专利技术的目的在于解决现有技术中Marcl45细胞或MA104细胞培养方法中存在的问题，提供一种大规模悬浮培养Marcl45细胞或MA104细胞的方法。本专利技术的悬浮培养Marcl45细胞或MA104细胞的方法包括如下步骤(1)利用包含能减弱细胞粘附性能基因序列的表达载体稳定转染Marcl45细胞或 MA104细胞；(2)筛选并分离稳定转染细胞克隆；(3)检测稳定转染细胞克隆中的基因表达；(4)稳定转染细胞克隆的悬浮培养。本专利技术进一步的目的是提供一种大规模悬浮培养Marcl45细胞或MA104细胞以生产蓝耳病疫苗的方法。附图说明图1表示实施例1中稳定转染Marcl45细胞克隆的RT-PCR检测图。其中，GAPDH 和18s RNA为内参基因，对照为未经转染的Marcl45细胞。A、B和C分别为分离到的稳定转染细胞克隆。RT-PCR结果显示，A、B和C三个稳定转染细胞克隆中均有siat7e基因的表达。图2表示实施例1中稳定转染Marcl45细胞克隆的细胞生长曲线。结果显示稳定转染Marcl45细胞克隆的生长特性正常。具体实施例方式通过对Marcl45细胞或MA104细胞基因组进行基因改造，获得适于悬浮培养的 Marc 145细胞或MA104细胞，结合细胞培养工艺，实现通过大规模悬浮培养Marcl45细胞或 MA104细胞以生产蓝耳病疫苗。本专利技术的悬浮培养Marcl45细胞或MA104细胞的方法包括如下步骤(1)利用包含能减弱细胞粘附性能基因序列的表达载体稳定转染Marcl45细胞或 MA104细胞；(2)筛选并分离稳定转染细胞克隆；(3)检测稳定转染细胞克隆中的基因表达；(4)稳定转染细胞克隆的悬浮培养。在所述的步骤(1)中，所述的基因序列为siat7e基因；载体可以是本
内常规的表达载体，例如质粒。所述的表达载体既可以根据本领域的常规技术手段自行制备， 还可以购买获得。将DNA导入真核细胞的方式有两种瞬时转染与稳定转染。在瞬时转染中重组DNA 导入感染性强的细胞系以获得目的基因暂时但高水平的表达。转染的DNA不必整合进宿主染色体，当有大量样品需要在短时间内分析时，尤其是在转染后的1到4天内收获细胞，所得的溶解产物用于检测目的基因的表达时，可以采用瞬时转染的方式。瞬时转染中DNA的暂时表达即为瞬时表达。稳定或持久的转染用于建立克隆的细胞系，这种细胞系中转染的目的基因整合到染色体DNA中并指导适量目的蛋白的合成。一般来说(由细胞类型决定)，形成稳定转染细胞的效率比瞬时转染的效率低1到2个数量级。利用可选择的遗传标记物有利于在非转染细胞的背景中分离出稀少的稳定转染体。稳定转染中整合基因的表达即为稳定表达。将基因导入真核细胞的方法有许多种，包括生化方法转染，物理方法转染以及病毒介导的转化等。具体而言包括DEAE (二乙氨乙基)-葡聚糖介导法，磷酸钙介导法，脂质体介导法，聚阳离子-DMSO转染法，生物粒子介导法，电穿孔转染法，显微注射法，病毒介导法等，优选采用脂质体介导法。所述的步骤(1)进一步包括如下步骤(a)用全长人类siat7e基因表达载体转染大肠杆菌DH5ci感受态细胞，纯化质粒； 纯化质粒的方法可以是本领域常规的技术手段，可以采取试剂盒或非试剂盒的方法；(b)转接1\105_5\10%11^145细胞或嫩104细胞于细胞培养板中，孵育细胞 20-24h,约40-90%汇合度；所述Marc 145细胞或MA104细胞可以是例如商品名为ATCC， Cat. No. CCL-34的市售商品；(c)取1-10 μ g的质粒DNA稀释于250 μ L转染培养基(如Opti-MEM培养基)中， 混勻；2-50 μ L脂质体稀释于250 μ L转染培养基中，轻轻混勻，静置5-15min ；(d)将上述制备的溶液混合，室温静置10-20min ；将步骤(b)中所述的细胞培养板中各个孔换成无血清无抗生素的0. 5-2mL转染培养基；将上述步骤(c)中的混合物转入步骤(b)所述的孵育细胞的细胞培养板孔中，轻轻前后晃动混勻；(e)37°C培养，l_24h后，将各个孔中的培养基换成完全培养基于37°C培养；(f)24h后，将细胞从细胞培养板中传至细胞培养瓶中。在所述步骤O)中，由于摄取、整合和表达外源DNA是小概率事件，通常根据新表型筛选稳定转染体。一般情况下，这种表型由共同转染的编码抗生素抗性的基因提供。表达一个DNA分子上的基因标记的细胞经常也表达另一 DNA分子携带的基因标记。因此，稳定表达选择性标记(如抗生素抗性)的细胞很可能也表达载体DNA上的其他DNA序列。这种物理上不相连的基因被整合到同一转化细胞内表达的现象叫做共转化。现有常用筛选标记包括氨基葡萄糖苷本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：王建超，陈文庆，张韧，
申请(专利权)人：北京清大天一科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。