一种吸附无细胞百白破联合疫苗的制备方法技术

本发明专利技术涉及利用百日咳、白喉、破伤风菌种培养类毒素制备百白破疫苗的方法，所述方法采用硫酸铵盐析、密度梯度离心、戊二醛脱毒的方式来制备包含有效抗原PT和FHA的无细胞百日咳原液，通过将制备所得到的百日咳原液与精致纯化得到的白喉类毒素和破伤风毒素混合最终制备得到可用于预防百日咳、白喉、破伤风三种疾病的无细胞百白破联合疫苗。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物医学
，本专利技术涉及利用百日咳、白喉、破伤风菌种培养类毒素制备成百白破疫苗，用于预防百日咳、白喉、破伤风三种疾病。
技术介绍
百日咳是一种常见的、传染性极强的呼吸道感染性疾病。百日咳病在中医上称为天哮呛、鹭鹚吼、疫咳等，我国早在十一世纪就有关于此病的治疗方法。1840年Monlton提到过百日咳病，1876年Sydenham详细描述了该病，称之为剧烈咳嗽的病。1900年由Bordet 和Gengon在患儿的咳痰涂片内找到了百日咳杆菌。由于该菌初次分离营养要求较高，直到 1906年他们采用了血液-甘油-马铃薯培养基才获得纯种。百日咳杆菌能引起人类急性呼吸道传染病，传染力强，发病持续时间长，故称百日咳(whoop cough或Pertussis)。百日咳杆菌能引起人类百日咳，以婴幼儿患者居多，主要是易感者与患者密切接触后，通过飞沫空气传播感染。百日咳病程较长，大约5 7周或更长，常见有流感嗜血杆菌、A群链球菌和肺炎球菌的继发感染，具有严重的预后结果，最常见的合并症为肺炎，是导致百日咳患儿死亡的主要原因。在患病的早期使用抗生素可能有效，百日咳杆菌对红霉素、氯霉素、氨苄青霉素、多粘菌素等抗生素均有较敏感。若在百日咳潜伏期和卡他期立即使用这些药物可以缩短病程，减轻病情。但是，如果进入了百日咳痉咳期，则所有抗菌素效果都不明显。百日咳杆菌致病机理至今尚不十分清楚。但体液内存在一定的抗体水平可保护机体免受百日咳杆菌感染已被证实。自20世纪30年代Medson等制成百日咳菌体疫苗以来，已在世界各国使用近60年。百日咳菌体疫苗在预防和控制百日咳中发挥了巨大的作用，使百日咳成为用疫苗可以预防的传染病，已列入世界卫生组织推行的扩大免疫计划(Expend Programme Immunization, EPI)中要控制的和消灭的传染病之一。破伤风是一种严重的疾病，它多发生于创伤后，由于患者伤口被破伤风杆菌感染， 在厌氧的条件下产生大量的毒素，进而侵害神经组织，导致患者全身性肌肉强直和阵发性痉挛，死于窒息及全身性衰竭。它多是散在发生，感染与发病也需要特定的条件，即创伤、污染、破伤风杆菌及厌氧条件。破伤风杆菌产生的毒素经甲醛解毒后，形成类毒素，可用于人群免疫接种，形成自动免疫，该方法是1925年通过动物法注射类毒素后，在血清中可测出相应的抗体，并能抗破伤风感染。白喉是一种严重的世界性的呼吸道传染病，人类是白喉杆菌的唯一宿主。它是由白喉棒状杆菌侵入到上呼吸道粘膜上皮组织，生长繁殖并产生外毒素引起炎症，产生纤维性渗出和组织破坏，形成典型的假膜，这种假膜牢固的附着在粘膜上，可引起呼吸障碍甚至窒息，同时白喉外毒素不断由病灶吸收，引起全身性中毒性症状、器官损害和急性死亡，主要是心肌、神经系统、肝、肾及肾上腺等器官的损害。自1923年发现经用甲醛处理白喉毒素后，可使白喉毒素的毒性消失而保持免疫原性，注射动物可产生中和抗体。我国目前应用于计划免疫预防百日咳、白喉、破伤风疾病的疫苗主要是在全细胞百日咳疫苗中加入白喉、破伤风类毒素的联合疫苗。自五十年代初我国已经开始生产该种疫苗，至今已使用了半个多世纪。虽然近半个世纪以来，在世界范围内许多国家已经广泛应用了疫苗，大大降低了白喉和破伤风疾病的发病率，但有关研究表明，在疫苗接种不完全区域的人群中仍时有百日咳和白喉发生，处于地方性低水平流行。在20世纪70年代末至80 年代初，在一些发达国家，如英国、瑞典、意大利和日本等由于停止百日咳菌体疫苗接种，发病率大幅度上升。1993年瑞典报告在未免疫的儿童中，60%在10岁前发生过典型的百日咳症状，其中90%儿童的血清百日咳毒素抗体呈阳性反应。因此，百日咳疫苗接种的长期性和保证完成全程免疫是非常重要和关键。根据WHO近期统计，全球每年仍有百日咳病人近 4000万，35. 7万人死亡。如非洲，发病率为2000/10万，5岁以下儿童的发病率高达20% 60%。在欧洲发病率约为0.35/10万 85/10万。在美国，百日咳的发病率从1981年的 0. 5/10万增加到1993年的2. 6/10万；澳大利亚尽管3针基础免疫覆盖率高达90%，百日咳发病率从1991年的2/10万增加到1994年的30. 5/10万。在荷兰疫苗接种率高达95%， 1996年仍发生了大范围的流行，发病率达18/10万。在我国，目前尚无百日咳感染的确切流行病学资料，尽管自1985年中国推行计划免疫，将百白破联合疫苗纳入第一批计划免疫的疫苗，使得百日咳的发病率急剧下降。但是，由于全细胞百白破联合疫苗易产生的副反应， 严重影响了划免疫的实施，使常规免疫的全国覆盖率尚未真正达到85%，造成百日咳的局部暴发流行的情况。如贵州省某镇1997年发生暴发流行，发病率高达20. 55% 085例/总人口 1387)，其中7岁以下儿童占44%，此次流行与疫苗接种率低、易感人群累积有关。浙江丽水报告，1984-1992年百日咳的发病率仍达17. 24/10万。由于百日咳在发病的早期症状不典型，不易诊断，但传染性却很强，所以难以控制传染源和切断传播途径，只有通过预防接种百日咳疫苗，减少易感人群，提高人群对百日咳的免疫水平，形成免疫屏障，才能达到控制和消灭百日咳的目的。有关流行病学调查证明全细胞百日咳疫苗对于控制百日咳疾病的流行非常有效，免疫人群后可提供中至高水平的保护作用。英国在1978年和1981年发生了两次因停止接种全细胞百日咳疫苗后最为严重的百日咳流行。1979年日本由于疫苗接种事故停止接种疫苗，使百日咳发生率大幅度上升。然而，由于全细胞百日咳疫苗具有复杂的生物学性状，而且有关其效力与毒性之间的关系不甚明了，因此尽管接种全细胞百日咳疫苗后是否会引起脑病已争论了许多年，但是，因接种疫苗引起或诱发严重副反应仍然是一个世界性的问题。与百日咳疫苗接种相关的副反应可以分为两大类。一类是常见副反应，包括局部和全身轻微副反应，前者如注射局部发生红晕、疼痛、肿胀，在接种百日咳菌体疫苗后的发生率为50%;后者如发烧、烦躁、嗜睡、厌食等副反应，吸附无细胞百日咳疫苗、白喉、破伤风类毒素联合疫苗(DTaP)明显比白喉和破伤风类毒素二联疫苗(DT)的副反应高。另一类为不寻常的副反应，局部的有硬结和化脓，血管神经性水肿等，全身副反应有呕吐、持续哭叫、 荨麻疹等，严重的可发生惊厥、虚脱、休克等，极少数人可引起永久性脑损伤。我国在1988 年由中国药品生物制品检定所组织进行了百日咳菌体疫苗人体接种反应观察，体温38. 5°C 以上的中强反应 6-8h 为 1. 62% -10. 57%,24h 为 2. 5% -11. 5%,48h 为 0-3. 84%。局部中强反应 24h 为 0-4. 38 %，48h 为 0-3. 22 %，72h 为 0-2. 63 %。化脓发生率为 0.87%。由于百白破疫苗中白喉、破伤风两种类毒素是已经被提纯精制过的有效蛋白抗原，而百日咳则为全细菌体制剂，即包含所有的有效抗原和毒性成分，所以注射百白破疫苗所发生的反应一般为百日咳所含的毒性组分所引起的异常反应，如接种后发生的发烧、红肿、硬结等，并不是疫苗本身所应该具备的性状，而是该疫苗本身含有除了人们所需要的有效抗原成分以外，本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：侯文礼，廖常茹，冯晓，赵志鹏，钟泽荣，
申请(专利权)人：成都康华生物制品有限公司，
类型：发明
国别省市：