一种吸附无细胞百白破和B型嗜血流感四价联合疫苗的制备方法技术

本发明专利技术公开了一种吸附无细胞百白破和B型嗜血流感四价联合疫苗的制备方法，包括步骤：S1，菌种库的建立：百日咳菌种库的建立、白喉棒状杆菌菌种库的建立、破伤风芽孢杆菌菌种库的建立和B型嗜血流感杆菌菌种库的建立；S2，百日咳原液的制备：硫酸铵盐析、密度梯度离心和戊二醛脱毒；S3，白喉类毒素制备；S4，破伤风类毒素制备；S4，B型嗜血流感毒素制备；S5，四价联合疫苗的配置。本发明专利技术为将百日咳原液、白喉类毒素、破伤风毒素和B型嗜血流感毒素混合制成四价联合疫苗，能够有效防治百日咳、白喉、破伤风和B型流感；采用水油乳剂MF59和PLG微粒替代氢氧化铝佐剂，能够有避免DTaP‑Hib的PRP多糖免疫反应降低的现象，提高DTaP‑Hib四联疫苗的可靠性和安全性。

A method for the preparation of a combined vaccine of acellular DPT and B hemophilic influenza

The invention discloses a preparation method of a four valence combined vaccine for acellular pertussis and B type hemophilic influenza, including the steps: the establishment of S1, the establishment of the strain Bank of pertussis, the establishment of the bacteria Library of Corynebacterium diphtheria, the establishment of the Bacillus species Library of the Bacillus tetanus and the establishment of the strain Library of the B type Haemophilus influenzae; S 2, the preparation of pertussis original solution: ammonium sulfate salting, density gradient centrifugation and glutaraldehyde detoxification; S3, diphtheria toxoid preparation; S4, tetanus toxoid preparation; S4, B type Haemophilus influenzotoxin preparation; S5, tetravalent combined vaccine configuration. The present invention is a combination of pertussis original solution, diphtheria toxoid, tetanus toxin and B type Haemophilus influenza toxin, which can effectively prevent pertussis, diphtheria, tetanus and B influenza. Using water oil emulsion MF59 and PLG particles instead of aluminum hydroxide adjuvant, the immune reaction of PRP polysaccharide immune to DTaP Hib can be avoided. Reduce the phenomenon and improve the reliability and safety of the DTaP Hib quadruple vaccine.

【技术实现步骤摘要】
一种吸附无细胞百白破和B型嗜血流感四价联合疫苗的制备方法
本专利技术具体涉及一种吸附无细胞百白破和B型嗜血流感四价联合疫苗的制备方法。
技术介绍
百日咳、白喉、破伤风混合疫苗简称百白破疫苗，它是由百日咳疫苗、精制白喉和破伤风类毒素按适量比例配制而成，用于预防百日咳、白喉、破伤风三种疾病。目前使用的有吸附百日咳疫苗、白喉和破伤风类毒素混合疫苗(吸附百白破)和吸附无细胞百日咳疫苗、白喉和破伤风类毒类混合疫苗(吸附无细胞百白破)。无细胞百白破联合疫苗由无细胞百日咳疫苗原液、白喉类毒素原液及破伤风类毒素原液加氢氧化铝佐剂制成。为乳白色悬液，放置后佐剂下沉，摇动后即成均匀悬液，含防腐剂。B型嗜血流感杆菌简称Hib，是一种引起婴幼儿严重疾病，甚至死亡的致病菌，在世界各地，Hib是引起儿童疾病的一个主要病因；Hib是导致5岁以下婴幼儿严重感染的主要病原体：在发展中国家，Hib侵袭性疾病是引起婴幼儿死亡的主要病因，主要引起肺炎，预后较差。在5岁以下化脓性脑膜炎病例中，Hib感染性脑膜炎约占60％，在发展中国家，Hib引起脑膜炎的死亡率可达到20％--50％。Hib诱发的其它常见感染有：小儿败血症、会厌炎、中耳炎、关节炎、心包炎等。DTaP-Hib四联疫苗即百白破和B型嗜血流感杆菌四联疫苗，可预防百日咳、白喉、破伤风及由B型嗜血流感杆菌引起的脑膜炎、肺炎、败血症、蜂窝组织炎、关节炎、会厌炎等传染性和感染性疾病。使用该疫苗，可减少接种次数、减少痛苦、降低接种脱落率。该疫苗需自费接种，如果经济条件许可，建议接种。现有研究发现，B型嗜血流感杆菌与单独吸附于氢氧化铝佐剂后，Hib的抗体降低5-11倍，造成DTaP-Hib的PRP多糖免疫出现反应降低的现象，降低了DTaP-Hib四联疫苗的可靠性和安全性。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服现有技术的缺点，提供一种吸附无细胞百白破和B型嗜血流感四价联合疫苗的制备方法，以解决因氢氧化铝佐剂造成DTaP-Hib四联疫苗的PRP多糖免疫反应降低的技术问题。为实现上述目的，本专利技术所采取的技术方案是：提供一种吸附无细胞百白破和B型嗜血流感四价联合疫苗的制备方法，包括以下步骤，S1，菌种库的建立百日咳菌种库的建立：将百日咳菌种接种于包-姜氏培养基上，于35～37℃培养不超过72小时，以后各代不超过48小时，传至第4代，培养24小时，刮下菌苔，于脱脂牛奶内混匀，分装后冷冻干燥，真空封口，-20℃保存，为主代种子批菌种；白喉棒状杆菌菌种库的建立：将白喉棒状杆菌菌种接种于林氏培养基上，于34℃培养24～48小时，再传代于林氏培养基上，连续传4代，离心后将菌体放置于脱脂牛奶内混匀，分装后冷冻干燥，真空封口，-20℃保存，为主代种子批菌种；破伤风芽孢杆菌菌种库的建立：将破伤风厌氧芽孢杆菌菌株接种于半固体碎肉培养基中管，放置于34℃孵箱内培养48小时，连续传4代，离心后将菌体放置于脱脂牛奶内混匀，分装后冷冻干燥，真空封口，-20℃保存，为主代种子批菌种；B型嗜血流感杆菌菌种库的建立：将B型嗜血流感杆菌菌种接种于PH7.4的包-姜氏培养基上，于35～37℃培养24～48小时，连续传4代，离心后将菌体放置于脱脂牛奶内混匀，分装后冷冻干燥，真空封口，-20℃保存，为主代种子批菌种；S2，百日咳原液的制备硫酸铵盐析：将百日咳主代种子批菌种稀释至浓度为40Lf/ml，加入硫酸铵溶液进行一次盐析、7日后经3500rPm离心40分钟，弃上清，沉淀中加入PBS进行一次浸提，每天搅拌2次，每次40分钟；经7000rPm离心60分钟弃沉淀、上清液中加高浓度的硫酸铵二次盐析、经9000rPm离心60分钟，收集沉淀加入PBS二次浸提3天，每天搅拌2次，每次1小时，包袋透析，铵根检测合格后，透析内液经16000rPm离心3小时收上清；密度梯度离心：经30000rpm蔗糖密度梯度离心18～20小时除去内毒素，收集糖浓度为4％～12％之间的样品，其中含有PT和FHA组分；戊二醛脱毒：将梯度离心后的中间品用PBS稀释为50μgPN/ml，然后加入戊二醛使之最终戊二醛浓度为0.5％，置于20℃脱毒，每1小时振摇一次，然后加入赖氨酸溶液，使之最终浓度为0.2％，置于20℃作用3小时；S3，白喉类毒素制备将白喉棒状杆菌主代种子批菌种稀释至浓度为40Lf/ml，加入浓度为0.5％的甲醛和9.125％的赖氨酸，pH调至7.0～7.2，在37～39℃下脱毒42天；S4，破伤风类毒素制备将破伤风厌氧芽孢杆菌主代种子批菌种稀释至浓度为40Lf/ml，加入浓度为0.5％的甲醛，加入的甲醛量为0.15％，放置于37℃温箱中加温脱毒25天；S4，B型嗜血流感毒素制备将B型嗜血流感杆菌主代种子批菌种稀释至浓度为40Lf/ml，加入浓度为0.5％的甲醛和9.125％的赖氨酸，pH调至7.0～7.2，放置于37℃温箱中加温脱毒25天；S5，四价联合疫苗的配置将百日咳原液、白喉类毒素、破伤风毒素、水油乳剂MF59和PLG微粒混合配置成百白破疫苗，再将B型嗜血流感毒素与百白破疫苗混合制得四价联合疫苗。本专利技术的有益效果为：1.本专利技术为将百日咳原液、白喉类毒素、破伤风毒素和B型嗜血流感毒素混合制成四价联合疫苗，能够有效防治百日咳、白喉、破伤风和B型流感；采用水油乳剂MF59和PLG微粒替代氢氧化铝佐剂，能够有避免DTaP-Hib的PRP多糖免疫反应降低的现象，提高DTaP-Hib四联疫苗的可靠性和安全性。具体实施方式为使本专利技术的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本专利技术具体实施例对本专利技术技术方案进行清楚、完整地描述。实施例1：一种吸附无细胞百白破和B型嗜血流感四价联合疫苗的制备方法，包括以下步骤，S1，菌种库的建立百日咳菌种库的建立：将百日咳菌种接种于包-姜氏培养基上，于35～37℃培养不超过72小时，以后各代不超过48小时，传至第4代，培养24小时，刮下菌苔，于脱脂牛奶内混匀，分装后冷冻干燥，真空封口，-20℃保存，为主代种子批菌种；白喉棒状杆菌菌种库的建立：将白喉棒状杆菌菌种接种于林氏培养基上，于34℃培养24～48小时，再传代于林氏培养基上，连续传4代，离心后将菌体放置于脱脂牛奶内混匀，分装后冷冻干燥，真空封口，-20℃保存，为主代种子批菌种；破伤风芽孢杆菌菌种库的建立：将破伤风厌氧芽孢杆菌菌株接种于半固体碎肉培养基中管，放置于34℃孵箱内培养48小时，连续传4代，离心后将菌体放置于脱脂牛奶内混匀，分装后冷冻干燥，真空封口，-20℃保存，为主代种子批菌种；B型嗜血流感杆菌菌种库的建立：将B型嗜血流感杆菌菌种接种于PH7.4的包-姜氏培养基上，于35～37℃培养24～48小时，连续传4代，离心后将菌体放置于脱脂牛奶内混匀，分装后冷冻干燥，真空封口，-20℃保存，为主代种子批菌种；S2，百日咳原液的制备硫酸铵盐析：将百日咳主代种子批菌种稀释至浓度为40Lf/ml，加入硫酸铵溶液进行一次盐析、7日后经3500rPm离心40分钟，弃上清，沉淀中加入PBS进行一次浸提，每天搅拌2次，每次40分钟；经7000rPm离心60分钟弃沉淀、上清液中加高浓度的硫酸铵二次盐析、经9000rPm离心60分钟，收集沉淀加入PBS二次浸提3天，每天搅拌2次，每次1小时，包袋透析，铵本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种吸附无细胞百白破和B型嗜血流感四价联合疫苗的制备方法，其特征在于，包括以下步骤，S1，菌种库的建立百日咳菌种库的建立：将百日咳菌种接种于包‑姜氏培养基上，于35～37℃培养不超过72小时，以后各代不超过48小时，传至第4代，培养24小时，刮下菌苔，于脱脂牛奶内混匀，分装后冷冻干燥，真空封口，‑20℃保存，为主代种子批菌种；白喉棒状杆菌菌种库的建立：将白喉棒状杆菌菌种接种于林氏培养基上，于34℃培养24～48小时，再传代于林氏培养基上，连续传4代，离心后将菌体放置于脱脂牛奶内混匀，分装后冷冻干燥，真空封口，‑20℃保存，为主代种子批菌种；破伤风芽孢杆菌菌种库的建立：将破伤风厌氧芽孢杆菌菌株接种于半固体碎肉培养基中管，放置于34℃孵箱内培养48小时，连续传4代，离心后将菌体放置于脱脂牛奶内混匀，分装后冷冻干燥，真空封口，‑20℃保存，为主代种子批菌种；B型嗜血流感杆菌菌种库的建立：将B型嗜血流感杆菌菌种接种于PH7.4的包‑姜氏培养基上，于35～37℃培养24～48小时，连续传4代，离心后将菌体放置于脱脂牛奶内混匀，分装后冷冻干燥，真空封口，‑20℃保存，为主代种子批菌种；S2，百日咳原液的制备硫酸铵盐析：将百日咳主代种子批菌种稀释至浓度为40Lf/ml，加入硫酸铵溶液进行一次盐析、7日后经3500rPm离心40分钟，弃上清，沉淀中加入PBS进行一次浸提，每天搅拌2次，每次40分钟；经7000rPm离心60分钟弃沉淀、上清液中加高浓度的硫酸铵二次盐析、经9000rPm离心60分钟，收集沉淀加入PBS二次浸提3天，每天搅拌2次，每次1小时，包袋透析，铵根检测合格后，透析内液经16000rPm离心3小时收上清；密度梯度离心：经30000rpm蔗糖密度梯度离心18～20小时除去内毒素，收集糖浓度为4％～12％之间的样品，其中含有PT和FHA组分；戊二醛脱毒：将梯度离心后的中间品用PBS稀释为50μgPN/ml，然后加入戊二醛使之最终戊二醛浓度为0.5％，置于20℃脱毒，每1小时振摇一次，然后加入赖氨酸溶液，使之最终浓度为0.2％，置于20℃作用3小时；S3，白喉类毒素制备将白喉棒状杆菌主代种子批菌种稀释至浓度为40Lf/ml，加入浓度为0.5％的甲醛和9.125％的赖氨酸，pH调至7.0～7.2，在37～39℃下脱毒42天；S4，破伤风类毒素制备将破伤风厌氧芽孢杆菌主代种子批菌种稀释至浓度为40Lf/ml，加入浓度为0.5％的甲醛，加入的甲醛量为0.15％，放置于37℃温箱中加温脱毒25天；S4，B型嗜血流感毒素制备将B型嗜血流感杆菌主代种子批菌种稀释至浓度为40Lf/ml，加入浓度为0.5％的甲醛和9.125％的赖氨酸，pH调至7.0～7.2，放置于37℃温箱中加温脱毒25天；S5，四价联合疫苗的配置将百日咳原液、白喉类毒素、破伤风毒素、水油乳剂MF59和PLG微粒混合配置成百白破疫苗，再将B型嗜血流感毒素与百白破疫苗混合制得四价联合疫苗。...

【技术特征摘要】
1.一种吸附无细胞百白破和B型嗜血流感四价联合疫苗的制备方法，其特征在于，包括以下步骤，S1，菌种库的建立百日咳菌种库的建立：将百日咳菌种接种于包-姜氏培养基上，于35～37℃培养不超过72小时，以后各代不超过48小时，传至第4代，培养24小时，刮下菌苔，于脱脂牛奶内混匀，分装后冷冻干燥，真空封口，-20℃保存，为主代种子批菌种；白喉棒状杆菌菌种库的建立：将白喉棒状杆菌菌种接种于林氏培养基上，于34℃培养24～48小时，再传代于林氏培养基上，连续传4代，离心后将菌体放置于脱脂牛奶内混匀，分装后冷冻干燥，真空封口，-20℃保存，为主代种子批菌种；破伤风芽孢杆菌菌种库的建立：将破伤风厌氧芽孢杆菌菌株接种于半固体碎肉培养基中管，放置于34℃孵箱内培养48小时，连续传4代，离心后将菌体放置于脱脂牛奶内混匀，分装后冷冻干燥，真空封口，-20℃保存，为主代种子批菌种；B型嗜血流感杆菌菌种库的建立：将B型嗜血流感杆菌菌种接种于PH7.4的包-姜氏培养基上，于35～37℃培养24～48小时，连续传4代，离心后将菌体放置于脱脂牛奶内混匀，分装后冷冻干燥，真空封口，-20℃保存，为主代种子批菌种；S2，百日咳原液的制备硫酸铵盐析：将百日咳主代种子批菌种稀释至浓度为40Lf/ml，加入硫酸铵溶液进行一次盐析、7日后经3500rPm离心40分钟，弃上清，沉淀中加入PBS进行一次浸提，每天搅拌2次，每次40分钟；经7000rPm离心60分钟弃沉淀、...

【专利技术属性】
技术研发人员：冯晓，侯文礼，
申请(专利权)人：成都康华生物制品有限公司，
类型：发明
国别省市：四川,51