本发明专利技术公开了一种可快速检测下呼吸道标本中流感嗜血杆菌（Haemophilus?influenzae）的多重降落PCR检测试剂盒。本发明专利技术属于下呼吸道感染性疾病的分子诊断技术领域，拟解决下呼吸道标本中流感嗜血杆菌的快速诊断。该试剂盒包括：10×PCR缓冲液，MgCl2，dNTP，TaqDNA聚合酶，BSA，流感嗜血杆菌阳性对照DNA，3对流感嗜血杆菌引物。本发明专利技术并建立了可检测流感嗜血杆菌的多重降落PCR检测试剂盒及检测方法，采用琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物。本发明专利技术建立的多重降落PCR检测试剂盒及检测方法快速、简便、特异、灵敏，可用于流感嗜血杆菌感染的快速诊断与流行病学调查。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及流感嗜血杆菌感染的分子诊断
，具体涉及多重降落PCR检测方法在下呼吸道标本中流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)检测中的应用。
技术介绍
流感嗜血杆菌是引起社区获得性肺炎的主要病原菌，为苛养菌，其培养需V因子与X因子。主要引起肺炎与脑膜炎，每年造成约300万人严重患病并造成约38. 6万人死亡。多数患者为5岁以下儿童。多数流感嗜血杆菌引起的死亡病例发生于发展中国家，这些国家尚未将流感嗜血杆菌疫苗纳入常规计划内免疫中(中国目前亦为计划外)。成人发生侵袭性流感嗜血杆菌肺炎的危险因素有免疫受损者、C0PD、糖尿病、癌症、脾切除与慢性酒精中毒、金黄色葡萄球菌或甲型流感病毒引起的重症肺炎。疫苗接种可预防由b型流感嗜血杆菌引起的侵袭性疾病的发生。发达国家由于疫苗的广泛接种，儿童流感嗜血杆菌肺炎已被消灭。但在未推广疫苗接种的国家，第年仍可造成数十万儿童死于流感嗜血杆菌感染引起的疾病。Guma M. K. Abdeldaim 等(Guma M. K. Abdeldaim, et al. , Detection ofHaemophilus influenzae in respiratory secretions from pneumonia patientsby quantitative real-time polymerase chain reaction. Diagn Microbiol InfectDisj 2009，64 (4) :366-373.)建立了以omp P6基因为靶标检测流感嗜血杆菌的实时定量PCR，然而他们发现该方法可将部分嗜血杆菌的其它菌种误鉴定为流感嗜血杆菌。同时针对流感嗜血杆菌的多个基因进行检测可提高检测方法的特异性。Korbie，D. J.等(Korbie，D.J. and J. S. Mattick,Touchdown PCR for increased specificity and sensitivity inPCR amplification. Nat. Protocols, 2008. 3 (9) :p. 1452-1456.)发现降落 PCR 可提高 PCR的特异性与灵敏度。当前尚无同时针对流感嗜血杆菌omp P6、frdB、16S rRNA基因以检测流感嗜血杆菌的多重PCR报道。本专利技术建立的多重降落PCR可直接检测下呼吸道标本中的流感嗜血杆菌，费时少，具高度特异性与灵敏性，有利于流感嗜血杆菌感染的快速诊断与流行病学调查。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是提供一种可快速特异检测下呼吸道标本中流感嗜血杆菌的多重PCR检测试剂盒及检测方法。为了解决上述技术问题，本专利技术是通过以下技术发案实现的一种流感嗜血杆菌多重降落PCR检测试剂盒，包括10 X PCR缓冲液，MgC12，dNTP,TaqDNA聚合酶，BSA,流感嗜血杆菌阳性对照DNA，3对流感嗜血杆菌引物； 第I 对5，-GAAATGGTGCTGCTCAAACTTT-3，( SEQ ID NO. I )与5’ -TGCGATGTTGTATTCTGGTGTA-3’ (SEQ ID NO. 2)；第2 对5，-CGATCAAGAGCCACATTTAAGC-3，( SEQ ID NO. 3)与5’ -CTTCTGAGCAATAGCCAACGA-3’ (SEQ ID NO. 4)；第3 对5，-CGTATTATCGGAAGATGAAAGTGC-3，(SEQ ID NO. 5) (HendolinPH, et al. Use of multiplex PCR for simultaneous detection of four bacterialspecies in middle ear effusions. J Clin Microbiol, 1997, 35(11):2854-2858.)与5’ -AGGATGTCAAGAGTAGGTAAGGTT-3’ (SEQ IDNO. 6)；本专利技术还公开了应用上述试剂盒的检测方法 (一)提取待检样本DNA(二)多重降落PCR法扩增检测待检样本DNA中的omp P6、frdB、16S rRNA基因，具体步骤如下 反应体系25H2O12.55 nl缓冲液(10XPCR)2.5 JilBSA (10 mg/ml)0.25 (ilHi—omp P6-F (10 MinoI/L)0. 5 \ilHi—omp P6-R (10 WiioI/L)0.5(11Hi—frdB-F (10 ttnol/L)ItU Hi—frdB-R (10 Wnol/L)IHi—16S rRNA-F (10 mol/L)Ipi Hi—16S rRNA-R (10 Wnol/L)IMgCl2 (25 mM)2 jilANTP (10 mM)0.5 filTaq DNA 聚合酶(.5 U/Ml )0.2 ^ilDNA 模板2 jil3对流感嗜血杆菌引物为Hi_omp P6-F:5’ -GAAATGGTGCTGCTCAAACTTT-3’ (SEQ ID NO. I)Hi_omp P6-R:5’ -TGCGATGTTGTATTCTGGTGTA-3J (SEQ ID NO. 2)Hi_frdB-F :5’ -CGATCAAGAGCCACATTTAAGC-3’ (SEQ ID NO. 3)Hi_frdB-R :5’ -CTTCTGAGCAATAGCCAACGA-3’ (SEQ ID NO. 4)Hi_16S rRNA-F :5’ -CGTATTATCGGAAGATGAAAGTGC-3J (SEQ ID NO. 5)Hi_16S rRNA-R:5’ -AGGATGTCAAGAGTAGGTAAGGTT-3J (SEQ ID NO. 6)(三)PCR反应循环参数如下94°C 5min ；94°C 30s, 65°C (每循环降低 0. 5°C ) 30s, 72°C lmin,20 个循环；94°C 30s, 55°C 30s, 72°C lmin, 20 个循环；72°C 7min。(四)电泳检测鉴定对多重降落PCR反应产物进行琼脂糖电泳检测，如电泳图中含有215bp、620bp、821bp条带中的任意2条或3条则代表检出流感嗜血杆菌。有益效果本专利技术所建立的多重降落PCR可克服常规培养的耗时长、灵敏度低等问题，具有快速、简便、特异、灵敏度高等特征。可于当天出检测结果报告，可同时检测流感嗜血杆菌的3个基因，对流感嗜血杆菌DNA的检测下限达0. 2pg。该多重降落PCR可用于流感嗜血杆菌感染的快速诊断与流行病学调查。附图说明图I为建立的多重降落PCR的特异性检测结果；泳道I 一 12模板依次对应为大肠埃希氏菌(Escherichia coli)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae)、鲍曼不动杆菌(Acinetobacter baumannii)、卡它莫拉菌(Moraxella (Branhamella) catarrhal is )、幾肠球菌(En本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1. 一种流感嗜血杆菌多重降落PCR检测试剂盒，包括=IOXPCR缓冲液，MgCl2, dNTP,Taq DNA聚合酶，BSA，流感嗜血杆菌阳性对照DNA，3对流感嗜血杆菌引物；其特征在于所述3对流感嗜血杆菌引物如下 第 I 对5，-GAAATGGTGCTGCTCAAACTTT-3，，与 5，-TGCGATG...
【专利技术属性】
技术研发人员：邵世和，罗欲承，杜蓬，侯艳娇，邵晨，潘红，
申请(专利权)人：江苏大学，
类型：发明
国别省市：
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