一种牛多杀性巴氏杆菌病二价灭活疫苗及其制备方法技术

本发明专利技术涉及一种牛多杀性巴氏杆菌病二价灭活疫苗，属于兽用生物制品制备技术领域。本发明专利技术的二价灭活疫苗由抗原和疫苗佐剂组成，其中抗原为牛多杀性巴氏杆菌荚膜A型Pm‑TJ株和牛多杀性巴氏杆菌荚膜B型C45‑2株。本发明专利技术制备的二价灭活疫苗采用了浓缩纯化工艺，并优化了牛多杀性巴氏杆菌荚膜B型C45‑2株的发酵培养工艺，使发酵时间缩短一半以上，提高生产效率，本发明专利技术的二价灭活疫苗可通过一针免疫同时预防由牛多杀性巴氏杆菌感染引起的牛纤维素性化脓性肺炎和牛出血性败血症，具有安全可靠、免疫效果良好的特点。

A bovine Pasteurella multocida two valent inactivated vaccine and preparation method thereof

The invention relates to a bovine Pasteurella multocida two valent inactivated vaccine, which belongs to the technical field of biological products for animal production system. The invention of the two valent inactivated vaccine by antigen and vaccine adjuvant, the antigen of bovine Pasteurella multocida capsular type A Pm TJ strains and bovine Pasteurella multocida capsular type 2 strains of C45 B. The prepared two valent inactivated vaccine using concentration and purification process, and optimize the fermentation process of cultured bovine Pasteurella multocida capsular type B C45 2 strains, shortens the fermentation time more than half, improve the production efficiency, the invention of the two valent inactivated vaccine by an immune prevention and by cattle Pasteurella multocida infection caused by bovine fibrinous suppurative pneumonia and hemorrhagic septicemia in cattle, it is safe and reliable, good immune effect.

【技术实现步骤摘要】
一种牛多杀性巴氏杆菌病二价灭活疫苗及其制备方法
本专利技术属于兽用生物制品
，具体涉及一种牛多杀性巴氏杆菌病二价灭活疫苗。
技术介绍
牛多杀性巴氏杆菌病是由牛多杀性巴氏杆菌感染牛引起的传染病。目前我国流行的牛多杀性巴氏杆菌病主要分为两种，一种是由牛多杀性巴氏杆菌荚膜A型菌引起的牛纤维素性化脓性肺炎，另一种是由牛多杀性巴氏杆菌荚膜B型菌引起的牛出血性败血症。其中牛纤维素性化脓性肺炎是严重侵害牛呼吸系统的疾病，健康牛混群后经长途运输等应激条件刺激下，发病率最高可达100％、死亡率可达40％。该病在我国属于新发传染病，近年已经蔓延至我国所有省份的主要养牛地区，成为了严重危害我国养牛产业的疾病之一。牛出血性败血症是以高热、肺炎、急性胃肠炎以及内脏器官广泛出血为特征的传染病，在我国已有几十年的流行历史，目前仍在多地呈散发或地方性流行。使用疫苗进行免疫接种是预防牛多杀性巴氏杆菌病的主要措施。但我国现有的牛多杀性巴氏杆菌灭活疫苗(简称B型菌单苗)只能预防牛巴氏杆菌荚膜B型菌引起的牛出血性败血症，针对预防牛多杀性巴氏杆菌荚膜A型菌引起的牛纤维素性化脓性肺炎尚无疫苗可用。现有的B型菌单苗系用免疫原性良好的荚膜B型多杀性巴氏杆菌C45-2株(CVCC44502)、C46-2株(CVCC44602)、C47-2株(CVCC44702)，根据需要可任选1-3株接种适应培养基培养，将培养物经甲醛溶液灭活后，加氢氧化铝胶制成；该疫苗采用肌肉或皮下注射，针对体重为100kg以下的牛，注射剂量为4ml，针对体重为100kg以上的牛，注射剂量为6ml。由此可见，B型菌单苗选择C45-2株、C46-2株、C47-2株共三株菌用于疫苗制备，在生产过程中，一级种子和二级种子的培养需分别进行培养，无疑增加了操作工艺，且较多的工序不利于控制疫苗批间差异。另外，因为注射剂量(4ml-6ml)较大，在临床规模化养殖场使用中，使得操作不方便且增加了操作时间；同时生产厂家在装量上，装同样头份数的疫苗需要更大的疫苗瓶才能满足，由此增加了包装成本。B型菌单苗能有效预防牛出血性败血症，但近二十年的临床运用中，有相关文章报道和个别客户实际反馈，B型菌单苗注射牛后，存在一定的副反应，严重情况下能导致牛的死亡；因此B型菌单苗的安全性有待进一步的提高。目前我国无商品化针对预防牛多杀性巴氏杆菌荚膜A型菌引起的牛纤维素性化脓性肺炎的疫苗。2006年，自我国爆发牛纤维素性化脓性肺炎疫情以来，中国农业科学院哈尔滨兽医研究所成功分离鉴定出了引起该疾病的病原：牛多杀性巴氏杆菌荚膜A型菌(微生物保藏号：CGMCCNo.3619)，并于2010年2月申请了专利《牛源荚膜A型多杀性巴氏杆菌及其分离鉴定和应用》(专利申请号CN201010115552.9)。该专利描述了将A型菌经BHI培养后，采用油佐剂制备为灭活疫苗，并通过小鼠模型证明能对A型菌强毒攻击提供完全保护，并与B型菌无交叉保护。鉴于多杀性巴氏杆菌不同血清型之间交叉免疫力差，现有商品化的产品无法有效防控荚膜A型菌引起的牛纤维素性化脓性肺炎，给牛多杀性巴氏杆菌病的防控带来了极大困难。因此，最好的方法是制备牛多杀性巴氏杆菌病二价疫苗，才能获得最佳的预防效果。
技术实现思路
为了解决现有技术中存在的问题，本专利技术的目的是提供一种牛多杀性巴氏杆菌病二价灭活疫苗。为了实现本专利技术目的，本专利技术的技术方案如下：一种牛多杀性巴氏杆菌病二价灭活疫苗，含有抗原和佐剂，抗原为牛多杀性巴氏杆菌荚膜A型Pm-TJ株和牛多杀性巴氏杆菌荚膜B型C45-2株，所述牛多杀性巴氏杆菌荚膜A型Pm-TJ株的保藏编号为CGMCCNo.3619，牛多杀性巴氏杆菌荚膜B型C45-2株的保藏编号为CVCC44502。所述佐剂为氢氧化铝胶。本专利技术的牛多杀性巴氏杆菌病二价灭活疫苗中，牛多杀性巴氏杆菌荚膜A型Pm-TJ株的有效含量为2.0-10.0×109CFU/mL；牛多杀性巴氏杆菌荚膜B型C45-2株的有效含量为2.0-10.0×109CFU/mL。优选地，牛多杀性巴氏杆菌荚膜A型Pm-TJ株的有效含量为6.0×109CFU/mL；牛多杀性巴氏杆菌荚膜B型C45-2株的有效含量为4.0×109CFU/mL。本专利技术提供了上述牛多杀性巴氏杆菌病二价灭活疫苗的制备方法，包括以下步骤：(1)牛多杀性巴氏杆菌荚膜A型Pm-TJ株和牛多杀性巴氏杆菌荚膜B型C45-2株分别进行发酵培养；(2)两个菌株的发酵菌液经离心或中空纤维浓缩纯化，灭活；(3)灭活后的两个菌液，按照体积比2：1混合，加入佐剂，充分混合，加入硫柳汞溶液，使其终浓度为0.005％，且疫苗中两种抗原的含量均不低于2.0×109CFU/mL。本专利技术的制备方法中，步骤(1)中牛多杀性巴氏杆菌荚膜A型Pm-TJ株的发酵培养方法为：将Pm-TJ株菌以1-2％接种量接种于制苗用脑心浸液培养基，35-37℃采用逐渐增大通气量的方法培养6-10小时，具体为0-3小时通气量为0.1m3/h/10L，3-6小时通气量为0.3m3/h/10L，6小时后通气量为0.5m3/h/10L，且最大通气量不超过0.5m3/h/10L。步骤(1)中牛多杀性巴氏杆菌荚膜B型C45-2株的的发酵培养方法为：将C45-2株菌以1％-2％接种量接种于制苗用含0.1％裂解血球全血的马丁肉汤培养基，35-37℃采用逐渐增大通气量的条件培养6-10小时，即0-3小时通气量为0.1m3/h/10L，3-6小时通气量为0.3m3/h/10L，6小时后通气量为0.5m3/h/10L，且最大通气量分别不超过0.5m3/h/10L。步骤(1)中两种菌发酵培养过程中均以不搅拌的方式进行培养。步骤(2)的离心方法为维持菌液流速为2000-3000ml/min，8000-12000r/min连续流离心，收集菌泥沉淀，并用pH7.2-7.4的无菌PBS重悬，制成10倍浓缩菌液。步骤(2)的离心方法为维持菌液流速为2500ml/min，10000r/min连续流离心，收集菌泥沉淀，并用pH7.2-7.4的无菌PBS重悬，制成10倍浓缩菌液。步骤(2)的中空纤维浓缩纯化方法为以0.22μm孔径中空纤维进行浓缩，压力控制在0.03Mpa以内，维持流速不超过300ml/min以内，使其浓缩为原倍菌液的1/10。本专利技术还提供了小鼠在上述牛多杀性巴氏杆菌病二价灭活疫苗的效力检验中的应用。本专利技术建立的用小鼠对本专利技术牛多杀性巴氏杆菌病二价灭活疫苗进行效力检验方法为：用体重18～22g小鼠5只，分别肌肉注射疫苗50μl，21日后，连同条件相同的对照鼠5只，各腹腔注射1.0×104MLD的牛多杀性巴氏杆菌Pm-TJ株强毒菌液，观察7日；对照组全部死亡，免疫组应至少4只保护。本专利技术还提供了兔在上述牛多杀性巴氏杆菌病二价灭活疫苗的效力检验中的应用。本专利技术建立的用兔对本专利技术牛多杀性巴氏杆菌病二价灭活疫苗进行效力检验方法为：用体重1.5～2.0kg兔5只，各肌肉或皮下注射疫苗0.5ml，21日后，连同条件相同的对照兔5只，各皮下注射1MLD牛多杀性巴氏杆菌C45-2株强毒菌液，观察8日。对照组全部死亡，免疫组应至少3只保护。本专利技术的有益效果在于：(1)本专利技术的二价灭活苗对目前我国流行的牛纤维素性化脓性肺炎本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种牛多杀性巴氏杆菌病二价灭活疫苗，其特征在于，含有抗原和佐剂，抗原为牛多杀性巴氏杆菌荚膜A型Pm‑TJ株和牛多杀性巴氏杆菌荚膜B型C45‑2株，所述牛多杀性巴氏杆菌荚膜A型Pm‑TJ株的保藏编号为CGMCC No.3619，牛多杀性巴氏杆菌荚膜B型C45‑2株的保藏编号为CVCC 44502。

【技术特征摘要】
1.一种牛多杀性巴氏杆菌病二价灭活疫苗，其特征在于，含有抗原和佐剂，抗原为牛多杀性巴氏杆菌荚膜A型Pm-TJ株和牛多杀性巴氏杆菌荚膜B型C45-2株，所述牛多杀性巴氏杆菌荚膜A型Pm-TJ株的保藏编号为CGMCCNo.3619，牛多杀性巴氏杆菌荚膜B型C45-2株的保藏编号为CVCC44502。2.根据权利要求1所述的牛多杀性巴氏杆菌病二价灭活疫苗，其特征在于，牛多杀性巴氏杆菌荚膜A型Pm-TJ株的有效含量2.0-10.0×109CFU/mL；牛多杀性巴氏杆菌荚膜B型C45-2株的有效含量为2.0-10.0×109CFU/mL。3.根据权利要求1所述的牛多杀性巴氏杆菌病二价灭活疫苗，其特征在于，牛多杀性巴氏杆菌荚膜A型Pm-TJ株的有效含量为6.0×109CFU/mL；牛多杀性巴氏杆菌荚膜B型C45-2株的有效含量为4.0×109CFU/mL。4.权利要求1-3任一所述牛多杀性巴氏杆菌病二价灭活疫苗的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)牛多杀性巴氏杆菌荚膜A型Pm-TJ株和牛多杀性巴氏杆菌荚膜B型C45-2株分别进行发酵培养；(2)两个菌株的发酵菌液经离心或中空纤维浓缩纯化，灭活；(3)灭活后的两个菌液，按照体积比2：1混合，加入佐剂，充分混合，加入硫柳汞溶液，使其终浓度为0.005％，且疫苗中两种抗原的含量均不低于2.0×109CFU/mL。5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中牛多杀性巴氏杆菌荚膜A型Pm-TJ株的发酵培养方法为：将Pm-TJ株菌以1～2％接种量接种于制苗用脑心浸液培养基，35℃～37℃采用逐渐增大通气量的方法培养6-10小时，且最大通气量不超过0.5m3/h/10L。6.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中牛多杀性巴氏杆菌荚膜B型C45-2株的的发酵培养方法为：将...

【专利技术属性】
技术研发人员：徐和敏，姜志刚，邵葳，于力，潘春刚，张爱民，罗显绎，姜晓红，马爱荣，周建民，
申请(专利权)人：中国农业科学院哈尔滨兽医研究所，中牧实业股份有限公司，
类型：发明
国别省市：黑龙江,23