本发明专利技术公开一种b型流感嗜血杆菌荚膜多糖的制备方法，通过溶解、除杂、精提、浓缩，得到b型流感嗜血杆菌荚膜多糖的精糖溶液。该制备工艺安全有效，对人体及环境无害。本发明专利技术制备的b型流感嗜血杆菌荚膜多糖精糖溶液中精糖的各项指标均符合药典要求，且纯度高；避免了苯酚的使用，使用的非离子表面活性剂均为低毒或无毒，且用量少，对人体及环境友好；能同时去除杂蛋白及氯化血红素对荚膜多糖的干扰，操作简便，工艺稳定，重现性好，且对设备要求低，成本低廉，适于大规模的生产。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于革兰氏阴性细菌荚膜多糖
，具体涉及一种b型流感嗜血杆菌 荚膜多糖的制备方法。
技术介绍
b型流感嗜血杆菌（Hib)不仅是我国小儿化脓性脑膜炎的首要原因，而且是小儿 肺炎的主要病因之一。近年来的研究表明，Hib已成为我国儿童呼吸道的首位致病菌，主要 引起下呼吸道感染，以肺炎为主，2岁以下幼儿感染率较高，据估计，每年Hib在全球可引起 至少300万严重病例和大约38. 6万死亡，加之抗生素耐药性菌株的不断增加，接种疫苗成 为预防绝大多数Hib严重病例的唯一公共卫生措施。WHO已经证明Hib结合疫苗的安全性 和有效性，应将该疫苗纳入全球儿童常规免疫规划。 有荚膜的b型流感嗜血杆菌是致病的罪魁祸首，其荚膜上的b型荚膜多糖与致病 力有很大关系。因此在Hib结合疫苗制备过程中其荚膜多糖的质量直接关系到疫苗最终的 免疫原性及副作用的产生。根据2010版中国药典可以知道，现行国内大部分的细菌类疫苗 的荚膜多糖从粗多糖到精糖提纯过程中普遍使用的是冷酚抽提法。该方法的主要缺点是苯 酚的大量使用，苯酚属高毒类物质，可通过皮肤、消化道、呼吸道吸收而出现全身中毒症状， 短期接触大量苯酚能引起中枢神经系统、肝肾、心肌、血液等多器官系统急性损害。苯酚对 皮肤黏膜有强烈的腐蚀作用，皮肤接触者除引起局部皮肤严重烧伤使皮肤肿胀、变黑坏死 夕卜，也可通过皮肤吸收进入体内而引起心、肝、肾、神经系统毒性作用。同时，含苯酚的废液 对自然环境的危害非常严重，如长期饮用苯酚污染的水，亦可引起慢性中毒反应，因此，要 严格控制这些废水进入环境。为此，人们正在寻找新方法来替代传统工艺中这些危险有毒 试剂的使用，这对于人类健康及自然环境的保护具有重要的现实意义。 传统工艺中Hib荚膜多糖的制备参照公开文献[Andersona人，INFERCTI0N ANDIMMUNITY. 1977，15(2) :472-477]，采用CY培养基对Hib菌株37°C进行发酵，发酵液 经甲醛灭活，离心取上清后，利用十六烷基三甲基溴化铵（CTAB)进行沉淀，同时，在沉淀过 程中有大量带有负电荷的蛋白也被沉淀下来。然后用〇. 5?1M的NaCl对复合物沉淀进行 解离，添加冰乙醇至终浓度25% (v/v)，沉淀核酸，然后加冰乙醇至终浓度75% (v/v)，沉淀 得到粗多糖。粗多糖用醋酸钠溶液溶解后，用冷酚抽多次抽提进行杂蛋白的去除，同时也去 掉发酵过程中没有被利用掉的氯化血红素。最后超滤浓缩去除苯酚残留，经75% (v/v)乙 醇沉淀得到精糖。 目前主要是利用柱层析对多糖进行纯化，2006年，Pato等人（Purificationof capsularpolysaccharidefromNeisseriameningitidesserogroupCbyliquid chromatography,Jotfraa/ 成ri?，832，262 - 267)利用柱层析法对C群 流脑荚膜多糖进行了纯化研究，而国内研究人员[解红艳等，层析法去除A群流脑多糖 疫苗粗糖中杂蛋白.中国生物工程杂志，2010，30(8) :88-92]对A群流脑荚膜多糖也进 行了纯化研究。虽然柱层析方法所得精糖检测指标均符合要求，但此方法受层析柱载样量 的限制，大规模生产时花费时间较长，而且在Hib粗多糖中常含有大量的未被利用的氯化 血红素，其中的铁离子容易与阴离子交换填料结合造成死吸附，填料的活化处理麻烦费时 长，填料浪费较大。 因此，有必要研发一种不使用苯酚且工艺简便的b型流感嗜血杆菌荚膜多糖的制 备方法。
技术实现思路
为克服目前纯化技术所存在的上述缺点，本专利技术提供了一种b型流感嗜血杆菌荚 膜多糖的制备方法，该制备工艺安全有效，对人体及环境无害。 本专利技术通过以下技术方案实现：，其 特征在于包括以下步骤： a、 将Hib粗多糖溶于体积浓度为3?30%的曲拉通X-100水溶液、曲拉通X-114水溶 液、吐温-80水溶液或乙基苯基聚乙二醇水溶液中，使Hib粗多糖的最终浓度为5?30mg/ mL，搅拌过夜，得粗糖溶解液； b、 在步骤a所得粗糖溶解液中添加（NH4) 2S04使使其质量浓度为20%?饱和，搅拌20? 30分钟后，在8000?lOOOOrpm下进行离心分离20?40分钟，取下层溶液； c、 在步骤b所得下层溶液中添加曲拉通X-100、曲拉通X-114、吐温-80或乙基苯基聚 乙二醇，使其体积浓度为3?30%，再搅拌30?60分钟后，在8000?lOOOOrpm下进行离心 分离20?40分钟，取下层溶液； d、 在步骤c所得下层溶液中添加无水乙醇至其体积浓度为2?20%，搅拌20?40分钟 后，在8000?lOOOOrpm下进行离心分离20?40分钟，取下层溶液； e、 将步骤d所得下层溶液用生理盐水稀释至所含荚膜多糖的浓度为10?4000mg/L，再 用100KD膜包进行超滤，所得浓缩液体即为b型流感嗜血杆菌荚膜多糖溶液。 所述步骤a中曲拉通X-100生理盐水溶液、曲拉通X-114水溶液、吐温-80水溶液、 乙基苯基聚乙二醇水溶液的pH为5. 5?7. 5。 所述步骤b、c、d均分别重复1?3次，收集下层溶液后再继续下一步骤。 所述步骤e中的超滤重复3?5次。 经过大量的实践摸索和反复验证，非离子表面活性剂不但是良好的蛋白溶剂，而 且非离子表面活性剂胶束又能包裹氯化血红素，本专利技术正是利用非离子表面活性剂的这种 特性，将蛋白与氯化血红素同时与多糖进行分离，且几乎无毒副作用，是替代苯酚的理想选 择。 与现有技术相比，本专利技术具有以下优点： 1、 本专利技术制备的b型流感嗜血杆菌荚膜多糖各项指标均符合药典要求，且纯度高，经 核磁检测本专利技术制备的b型流感嗜血杆菌荚膜多糖在结构上与传统方法完全一致； 2、 本专利技术在制备过程中，避免了苯酚的使用，使用的非离子表面活性剂（曲拉通X-100、 曲拉通X-114、吐温-80、乙基苯基聚乙二醇）均为低毒或无毒，且用量少，对人体及环境友 好； 3、 本专利技术能同时去除杂蛋白及氯化血红素对荚膜多糖的干扰，操作简便，且不受载样 量的限制，工艺稳定，重现性好，且对设备要求低，成本低廉，适于大规模的生产。 【具体实施方式】 下面通过实施例对本专利技术做进一步说明。 实施例1 a、 将Hib粗多糖5g溶于体积浓度为5%(v/v)的曲拉通X-100水溶液（pH为7. 5)中， 使Hib粗多糖的最终浓度为5mg/mL，搅拌过夜，得粗糖溶解液； b、 在步骤a所得粗糖溶解液中添加600g的（NH4)2S04使其质量浓度为50%(w/v)，搅拌 25分钟后，在SOOOrpm下进行离心分离20分钟，取下层溶液，该步骤重复2次，收集下层溶 液； c、 在步骤b所得下层溶液中添加曲拉通X-100,使其体积浓度为10%(v/v)，再搅拌30 分钟后，在SOOOrpm下进行离心分离20分钟，取下层溶液，该步骤重复3次，收集下层溶液； d、 在步骤c所得下层溶液中添加无水乙醇至其体积浓度为10%(v/v)，搅拌30分钟后， 在SOOOrpm下进行离心分离20分钟，取下层溶液，该步骤重复2次，收集下本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种b型流感嗜血杆菌荚膜多糖的制备方法，其特征在于包括以下步骤：a、将Hib粗多糖溶于体积浓度为1～30%的曲拉通X‑100水溶液、曲拉通X‑114水溶液、吐温‑80水溶液或乙基苯基聚乙二醇水溶液中，使Hib粗多糖的最终浓度为5～30mg/mL，搅拌过夜，得粗糖溶解液；b、在步骤a所得粗糖溶解液中添加(NH4)2SO4使其质量浓度为20%至饱和，搅拌20～30分钟后，在8000～10000rpm下进行离心分离20～40分钟，取下层溶液；c、在步骤b所得下层溶液中添加曲拉通X‑100、曲拉通X‑114、吐温‑80或乙基苯基聚乙二醇，使其体积浓度为3～30%，再搅拌30～60分钟后，在8000～10000rpm下进行离心分离20～40分钟，取下层溶液；d、在步骤c所得下层溶液中添加无水乙醇至其体积浓度为2～20%，搅拌20～40分钟后，在8000～10000rpm下进行离心分离20～40分钟，取下层溶液；e、将步骤d所得下层溶液用生理盐水稀释至所含荚膜多糖的浓度为10～4000mg/L，再用100KD膜包进行超滤，所得浓缩液体即为b型流感嗜血杆菌荚膜多糖溶液。
【技术特征摘要】
1. 一种b型流感嗜血杆菌荚膜多糖的制备方法，其特征在于包括以下步骤： a、 将Hib粗多糖溶于体积浓度为1?30%的曲拉通X-100水溶液、曲拉通X-114水溶 液、吐温-80水溶液或乙基苯基聚乙二醇水溶液中，使Hib粗多糖的最终浓度为5?30mg/ mL，搅拌过夜，得粗糖溶解液； b、 在步骤a所得粗糖溶解液中添加（NH4)2S04使其质量浓度为20%至饱和，搅拌20? 30分钟后，在8000?lOOOOrpm下进行离心分离20?40分钟，取下层溶液； c、 在步骤b所得下层溶液中添加曲拉通X-100、曲拉通X-114、吐温-80或乙基苯基聚 乙二醇，使其体积浓度为3?30%，再搅拌30?60分钟后，在8000?lOOOOrpm下进行离心 分离20?40分钟，取下层溶液； d、 在步骤c所得下层溶液中添加无水乙醇至其...
【专利技术属性】
技术研发人员：廖国阳，朱文勇，寸怡娜，李卫东，马磊，钟汉斌，代小虎，欧阳圣洁，王明清，管娇琼，胡文著，宋绍辉，蔡玮，高菁霞，张新文，戴宗祥，姜述德，
申请(专利权)人：中国医学科学院医学生物学研究所，
类型：发明
国别省市：云南;53
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