本发明专利技术公开了一种猪链球菌2型荚膜多糖抗体的酶联免疫试剂盒及应用，所述的试剂盒还包括抗原酶标板、稀释液A、脱脂奶粉、阳性对照、阴性对照、洗涤液、羊抗猪酶标二抗、显色液A、显色液B、终止液；抗原酶标板是以猪链球菌2型荚膜多糖作为抗原；阳性对照为猪链球菌2型菌免疫过的猪阳性对照血清；洗涤液含有Tween-20的PBS缓冲液；终止液含有氢氟酸溶液；显色液A含有过氧化氢脲的柠檬酸盐缓冲液，显色液B液含TMBpH5.0的柠檬酸/柠檬酸钠缓冲液；稀释液A含有Tween-20的PBS缓冲液。试剂盒在检测猪链球菌2型荚膜多糖抗体的酶联免疫中的应用。猪链球菌2型荚膜多糖的使用，特异性好，灵敏度高。检测时间短，一般2个小时内即可出结果。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及动物疫病检测，具体涉及一种猪链球菌2型荚膜多糖抗体的酶联免疫试剂盒，同时还涉及一种猪链球菌2型荚膜多糖抗体的酶联免疫试剂盒的用途，适用于检测猪血清中的猪链球菌2型的荚膜多糖的抗体水平。
技术介绍
猪链球菌(streptococcus suis)是一种能引起人、猪和其他动物感染、发病的重要致病菌。根据荚膜多糖分型，猪链球菌有35个血清型，即1/2型和1-34型(后来研究认为32和34型属于Streptococcus orisratti)。其中猪链球菌2型(SS2)是毒力最强、流行最广的血清型。国外自1968年荷兰首次报道人感染脑膜炎病例以来已有200多人因感 染猪链球菌死亡。在我国，自七十年代以来该病在全国二十多个省市已发生或流行，造成了不同程度的经济损失。2005年6 8月间，四川省资阳市、内江市等地区暴发流行猪链球菌2型病，并导致204人感染，38人死亡。在其它省市也有零星发生。由此可见，该病在我国广泛存在并严重流行，已成为当前严重危害养猪业发展的一种主要疾病，不仅给养猪业造成巨大经济损失，而且给人类也造成了严重的危害。为了有效地预防和控制猪链球菌2型病，在加强免疫预防的同时，使用特异、敏感、快速、便于操作的诊断和检测方法，为有效预防和控制猪链球菌2型的发生提供有力的手段和重要的工具。本专利技术应用提取的猪链球菌2型的荚膜多糖及ELISA检测技术，使试剂盒具有很好的敏感性和特异性，能大通量的检测猪血清中的猪链球菌2型荚膜多糖的抗体。
技术实现思路
本专利技术的目的是在于提供了一种猪链球菌2型荚膜多糖抗体的酶联免疫试剂盒，该试剂盒的优点是使用了猪链球菌2型的荚膜多糖作为抗原，使试剂盒的检测具有良好的灵敏性和特异性。本专利技术的另一个目的是在于提供了一种猪链球菌2型荚膜多糖抗体的酶联免疫试剂盒在检测猪链球菌2型荚膜多糖抗体的酶联免疫中的应用，将提取的猪链球菌2型荚膜多糖作为抗原包被于聚苯乙烯微孔板上，然后加待检血清孵育，再加入羊抗猪酶标抗体(购自Southern biotechnology associates (SBA)),显色时应出现两种情况,如果待检血清是阳性，那么此时加入的羊抗猪酶标抗体就会继续与阳性血清中的抗体反应，酶标仪检测数值就会越高。如果是待检血清阴性，那么羊抗猪酶标抗体就不会与ELISA板上猪链球菌2型荚膜多糖抗原反应，得到的数值就会低。该试剂盒特异性好、敏感性高。目前国内还无同类商业化的产品。有着良好的应用前景。为了实现上述的目的，本专利技术采用以下技术措施一种猪链球菌2型荚膜多糖抗体的酶联免疫的试剂盒，包括猪链球菌2型荚膜多糖包被的抗原酶标板。所述的试剂盒还包括抗原酶标板、稀释液A、脱脂奶粉(市售伊利奶粉)、阳性对照、阴性对照、洗涤液、羊抗猪酶标二抗、显色液A、显色液B、终止液。所述的抗原酶标板是以猪链球菌2型荚膜多糖作为抗原，在包被聚苯乙烯微孔板时用O. lmol/L, pH9. 6的碳酸氢钠溶液作为包被缓冲液。所述的猪链球菌荚膜多糖是从猪链球菌2-LT株(CCTCC NO M2011282)中提取所得，所述的猪链球菌2-LT株已于2011年8月9日保藏在中国典型培养物保藏中心，CCTCC NO :M2011282。(专利申请号:201110234192. 9)所述的阳性对照为猪链球菌2型菌免疫过的猪阳性对照血清，所述的阴性对照为未感染过和未免疫过猪链球菌的健康猪阴性血清。所述的洗涤液为含有O. 05% (体积比)Tween-20的PBS缓冲液；所述的终止液为含O. 25%体积比氢氟酸溶液。 所述的显色液A为含有50mg/mL过氧化氢脲的柠檬酸盐缓冲液，显色液B液为含有O. 2mg/mL TMB pH5. O的柠檬酸/柠檬酸钠缓冲液。所述的稀释液A为含有O. 05%体积比Tween-20的PBS缓冲液。一种猪链球菌2型荚膜多糖的制备方法，其制备过程是溶菌酶处理与冷酚提取相结合。具体分为两步一、使用改良的溶菌酶处理法(林树乾等，金黄色葡萄球菌荚膜多糖的制备及生物学特性，家畜生态学报，第27卷第6期)，将灭活的猪链球菌2型菌液使用灭菌生理盐水洗三遍，再用原菌液1/10体积的O. 01mol/L PBS将其重悬，加入终浓度O. lmol/L的甘氨酸，并加入终浓度3mg/L溶菌酶(购自北京普博欣生物科技有限公司)，置37°C下过夜(8 10小时)，室温14000r/min离心45分钟，收集上清，再加入终浓度为25%的无水乙醇和终浓度为O. lg/L的CaCl2，置2 8°C下作用2小时，12000r/min离心10分钟，收集上清，然后加入终浓度为80%的无水乙醇，置2 8°C下作用12小时，12000r/min离心10分钟，得到的沉淀即为粗制荚膜多糖。二、用冷酚处理法(林树乾等，金黄色葡萄球菌荚膜多糖的制备及生物学特性，家畜生态学报，第27卷第6期)，将粗制多糖进行纯化。将得到的粗制多糖用IOml饱和醋酸钠重悬，加入预冷的苯酚，快速振摇30分钟，8°C 4000r/min离心，收集上清液，重复三次，再将所得的的上清液装入透析袋用lmol/L的NaCl溶液透析48小时，收集透析内液，然后加入终浓度为55%的无水乙醇，置2 8°C下作用24小时，12000r/min离心10分钟，取沉淀干燥后用IOmlPBS溶解，即为精制荚膜多糖。一种猪链球菌2型荚膜多糖抗体的酶联免疫的试剂盒在检测猪链球菌2型荚膜多糖抗体的酶联免疫中的应用，其步骤是I)将脱脂奶粉溶于稀释液A中，使其脱脂奶粉的终浓度为5%，作为待检血清和对照血清的稀释液。2)取抗原包被板(包被有猪链球菌2型荚膜多糖抗原的检测板)，先用稀释好的洗涤液洗板2次，再将稀释好的待检血清、阴性对照血清和阳性对照血清各取100 μ I加入到抗原包被板孔中。待检血清设I孔，阴性对照和阳性对照各设2孔。轻轻振匀孔中样品(勿溢出)，置37°C下温育30分钟。3)弃去孔中的溶液，每孔加入稀释好的洗涤液200 μ 1，静置3分钟后，弃去洗涤液，并在吸水纸上拍干，重复洗板5次，最后一次在吸水纸上拍干。4)每孔加羊抗猪酶标二抗100 μ 1，置37°C下温育30分钟后洗板5次(方法同步骤3)。5)每孔加显色液A、显色液B各一滴(约50 μ L)，混匀，室温(18 25°C，以下相同)避光显色10分钟。每孔加终止液一滴(约50 μ L)，10分钟内用酶标仪测定每孔0D630nm读值。本专利技术试剂盒判定标准为在酶标仪上测各孔0D630nm值，试验成立的条件是；阳性对照孔0D630nm值均应彡O. 8，且< 2. O ;阴性对照孔0D630nm值均应< O. 3。如果样品0D630nm值彡O. 35，判为阳性；如果样品00630_值< O. 35，则判为阴性。本专利技术具有以下优点和效果 I.目前国内还无同类商业化的产品2.由于猪链球菌2型荚膜多糖的使用，特异性好，灵敏度高。3.操作简单，检测时间短，一般2个小时内即可出结果；附图说明图I为一种用苯酚硫酸法测定荚膜多糖时绘制的标准曲线示意图。图中横坐标为糖浓度，纵坐标为OD值。图2为一种使用分光光度计对荚膜多糖进行质量检测示意图。图中横坐标为波长，纵坐标为吸光值。具体实施例方式为了使本专利技术更加容易理解，下面本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种猪链球菌2型荚膜多糖抗体的酶联免疫试剂盒，包括猪链球菌2型荚膜多糖包被的抗原酶标板，其特征在于：所述的试剂盒还包括抗原酶标板、稀释液A、脱脂奶粉、阳性对照、阴性对照、洗涤液、羊抗猪酶标二抗、显色液A、显色液B、终止液；所述的抗原酶标板是以猪链球菌2型荚膜多糖作为抗原，在包被聚苯乙烯微孔板时用0.1mol/L，pH9.6的碳酸氢钠溶液作为包被缓冲液；所述的阳性对照为猪链球菌2型菌免疫过的猪阳性对照血清；所述的阴性对照为未感染过和未免疫过猪链球菌的健康猪阴性血清；所述的洗涤液为含有0.05%体积比Tween？20的PBS缓冲液；所述的终止液为含0.25%体积比氢氟酸溶液；所述的显色液A为含有50mg/mL过氧化氢脲的柠檬酸盐缓冲液，显色液B液为含有0.2mg/mL？TMB？pH5.0的柠檬酸/柠檬酸钠缓冲液；所述的稀释液A为含有0.05%体积比Tween？20的PBS缓冲液。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：康超，金梅林，徐高原，郭学波，董晓晖，肖圣建，
申请(专利权)人：武汉科前动物生物制品有限责任公司，华中农业大学，
类型：发明
国别省市：
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