猪口蹄疫病毒非结构蛋白3ABC抗体酶联免疫检测试剂盒制造技术

本发明专利技术公开了一种猪口蹄疫病毒非结构蛋白3ABC抗体酶联免疫检测试剂盒。它包括口蹄疫病毒非结构蛋白3ABC抗原表位多肽包被的酶联反应板和酶标记抗抗体；所述口蹄疫病毒非结构蛋白3ABC抗原表位多肽为序列表中序列1所示的多肽。本试剂盒使用化学合成非结构蛋白3ABC抗原肽包被反应板，抗原用量少、灵敏性和特异性高，可以高效地检测是否存在口蹄疫病毒感染。本发明专利技术试剂盒特异性好、敏感、高效，具有良好的市场前景。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物
，更具体地，本专利技术涉及一种口蹄疫病毒非结构蛋白抗体酶联免疫检测试剂盒，特别是猪口蹄疫病毒非结构蛋白3ABC抗体酶联免疫检测试剂盒。
技术介绍
口蹄疫(foot-and-mouthdisease，FMD)是由口蹄疫病毒(foot-and-mouth diseasevirus,FMDV)感染引起的偶蹄动物共患的一种烈性传染病。口蹄疫的致死率很低，但是感染率很高。发病的主要症状为：口腔粘膜、舌、唇、鼻镜、蹄叉、乳头等部位发生水疱，破溃形成烂斑，病畜蹄痛卧地、严重者蹄壳边缘溃裂或脱壳。不同动物的症状稍有不同，妊娠母牛可能流产，而后导致繁殖力降低；猪则以破蹄为最主要症状；山羊和绵羊的症状通常比牛温和。口蹄疫传染性高，传播迅速，感染猪、牛、羊等牲畜常导致幼畜死亡，成年动物生产能力急剧下降，严重危害畜牧业的发展和畜产品的生产供应。由于其在世界范围内广泛分布，能感染70多种家养和野生动物，且发病率极高(约为100％)，严重影响畜牧业生产和国际贸易，因而受到各国的高度重视。国际兽医局(OIE)在1984年修订的动物传染病分类中将口蹄疫列为A类传染病之首。口蹄疫病毒(FMDV)是小RNA病毒科(picornavi-ridae)，口蹄疫病毒属(aphthovirus)的成员，由一条长约8500个核苷酸的单股、正链RNA和衣壳蛋白组成。病毒衣壳由4种结构蛋白即VP1、VP2、VP3和VP4各60个拷贝组成，其中VP1和VP3是主要免疫性抗原。口蹄疫病毒(FMDV)具有多型性、易变性等特点，具有7个血清型，分别为A、O、C、SATI、SATII、SATIII及AsiaI型，每个型又可分为若干个亚型，目前发现的亚型有70多个。由于不断发生抗原漂移，因此并不能严格区分亚型。血清型间几乎无交叉免疫反应，同一型内部不同毒株之间抗原性也有一定变化，这就给口蹄疫的诊断和防治工作带来很大难度。口蹄疫病毒基因所编码产生的非结构蛋白有L、2A、2BC、3AB、3ABC、3D等，其中L蛋白的免疫原性比其他非结构蛋白弱，感染动物不一定能产生抗体，即使产生抗体，维持的时间也比较短。病毒感染动物可产生抗2B抗体，但这种抗体在ELISA反应中重复性不好，不能作为检测抗体。2C抗体由于消退的比3ABC快，且免疫牛中可检测到2C抗体，因此也不能作为检测指标。3D又称病毒感染相关抗原，没有型特异性，检测其抗体水平是评价动物是否接触过抗原的重要指标，也是国际贸易必检项目。目前认为仅检测3D抗体不能区分感染动物与免疫动物，因为疫苗中往往含有痕量的非结构抗原，经过多次免疫后，在免疫动物体内也能检测到3D抗体。3ABC聚蛋白中，3A免疫原性最强，3C免疫原性较弱。许多资料认为3ABC作为感染的标志可信度较大。检测3ABC抗体是确诊感染的重要指标。现在各国学者已达成共识，检测非结构蛋白3ABC或者3AB抗体是确认疫苗免疫动物是否感染FMD的最佳方法。口蹄疫的防控主要是疫苗免疫及屠宰感染和可疑畜群。我国对口蹄疫施行强制性免疫，每年春秋进行一次集中免疫，两次之间对新补栏家畜及时进行补免。在实际生产中如何鉴别诊断易感动物是进行了疫苗免疫还是感染了口蹄疫病毒对口蹄疫防疫体系的建立、检验检疫都是十分重要的。用于口蹄疫诊断的血清学技术有补体结合试验(CFT)、酶联免疫吸附试验(ELISA)、病毒中和试验(VNT)、间接血凝试验(IHA)等，其中ELISA是最常用的方法。ELISA的基本原理是将抗原或者抗体吸附于固相载体，在载体上进行免疫酶反应，通过底物显色后用肉眼或者分光光度计判定结果。ELISA方法具有特异、敏感、快速、简便、可靠性好等特点，且能自动化操作，并能迅速的检测大量样品，在FMD的诊断中日益受到人们的重视，现已成为国际上检测易感动物猪、牛等是否疫苗免疫或感染病毒的常规方法之一。间接ELISA方法过程简单易于操作，并且有较高的敏感性。1997年意大利的De等建立了基于FMDV3ABC非结构蛋白的间接捕获ELISA技术，这种ELISA用单抗来捕获在大肠杆菌中表达的FMDV3ABC非结构蛋白。用此ELISA检测了大量疫苗免疫动物和感染动物，所有经过攻毒试验的动物其ELISA试验的OD值都大于0.2，超过99％的经过疫苗免疫动物ELISA结果为阴性(即小于0.2)，因此将OD值小于0.2的样品判为阴性。以上数据显示该方法敏感性很高。后经特异性试验证实，该方法的特异性超过99.5％。此方法可在免疫后8天测出3ABC非结构蛋白抗体，1年后仍能测出此抗体。2003年朱彩珠等建立了一种用于区分FMDV感染动物和疫苗免疫动物的间接ELISA，这种ELISA利用大肠杆菌表达的FMDV3ABC非结构蛋白作为抗原。试验结果证明，该ELISA方法的准确性比病毒感染相关抗原琼脂糖凝胶免疫扩散试验(VIAAAGID)高。2010年张润祥等为建立牛口蹄疫抗体的检测方法，将FMDV的VP2基因通过pPROEXTMHTb表达载体在大肠杆菌DH5α中表达，获得大小为35ku的重组VP2蛋白(rVP2)。以纯化rVP2为抗原建立了FMDV-rVP2间接ELISA方法。重复性实验证实批内、批间变异系数均小于10％。检测非免疫无口蹄疫国家牛阴性血清的特异性为100％；检测感染血清敏感性为97.3％；检测O-Asia Ⅰ二价苗免疫牛血清，与4种商品化试剂盒比较，其符合率分别为69.0％、95.0％、90.4％和86.8％，符合率较高，说明这种ELISA有良好的应用价值。口蹄疫是关系到国家经济安全的重大动物疫病，相关关键技术应该牢牢掌握在自己手里。一旦我们拥有自主知识产权，将利于保障我国的经济安全。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种新的用于口蹄疫易感动物猪疫苗免疫与病毒感染的鉴别诊断的酶联免疫检测试剂盒。本专利技术的猪口蹄疫病毒非结构蛋白3ABC抗体酶联免疫检测试剂盒，包括猪口蹄疫病毒非结构蛋白3ABC抗原表位多肽包被的酶联反应板和酶标记抗抗体；所述猪口蹄疫病毒非结构蛋白3ABC抗原表位多肽为序列表中序列1所示的多肽。所涉及的包被抗原采用固相化学合成的方法生产，包被抗原含有猪口蹄疫病毒非结构蛋白3ABC的主要抗原位点多肽，可与口蹄疫病毒感染后产生的非结构蛋白3ABC抗体特异结合。所述酶标记抗抗体的标记酶为辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶；所述酶标记抗抗体为酶标记兔抗猪IgG；所述酶标记抗抗体优选为辣根过氧化物酶标记的兔抗猪IgG多本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种多肽，为序列表中序列1所示。

【技术特征摘要】
1.一种多肽，为序列表中序列1所示。
2.一种猪口蹄疫病毒非结构蛋白3ABC抗体酶联免疫检测试剂盒，包括
猪口蹄疫病毒非结构蛋白3ABC抗原表位多肽包被的酶联反应板和酶标记抗
抗体；所述猪口蹄疫病毒非结构蛋白3ABC抗原表位多肽为序列表中序列1
所示。
3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于：所述酶标记抗抗体的标
记酶为辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶；所述酶标记抗抗体为酶标记兔抗猪IgG，
所述酶标记抗抗体优选为辣根过氧化物酶标记的兔抗猪IgG多克隆抗体。
4.根据权利要求2或3所述的试剂盒，其特征在于：所述酶联反应板为
可拆卸96孔酶标板；所述口蹄疫病毒非结构蛋白3ABC抗原表位多肽为化学
人工合成得到。
5.根据权利要求2或3所述的试剂盒，其特征在于：所述猪口蹄疫病毒
非结构蛋白3ABC抗原表位多肽包被的酶联反应板的获得方法是将所述猪口
蹄疫病毒非结构蛋白3ABC抗原表位多肽溶于100μl的pH 9.6的碳酸盐溶液，
然后加到96孔聚苯乙烯酶联反应板，每孔50ng抗原，在37℃放置2～4小时，
再4-8℃下放置8～12小时使多肽抗原与酶联反应板充分结合，然后按照300μl/
孔加入含有1g/100ml牛血清白蛋白pH7.4的PBS缓冲液，37℃封闭处理2～3
小时...

【专利技术属性】
技术研发人员：齐鹏，董春娜，王楠，肖进，赵洪涛，张君，张艳宾，张欣，
申请(专利权)人：中牧实业股份有限公司，
类型：发明
国别省市：北京;11