本发明专利技术公开了一种口蹄疫A型病毒结构蛋白VP1抗体酶联免疫检测试剂盒。该口蹄疫A型病毒结构蛋白抗体酶联免疫检测试剂盒，包括口蹄疫A型病毒结构蛋白VP1抗原表位多肽包被的酶联反应板和酶标二抗；所述口蹄疫A型病毒结构蛋白VP1抗原表位多肽为序列表中序列1所示的多肽、序列表中序列2所示的多肽和序列表中序列3所示的多肽中的一种或两种以上任意组合。本试剂盒使用化学合成VP1抗原肽包被反应板，抗原用量少、灵敏性和特异性高，可以高效地检测是否存在感染或免疫后产生的口蹄疫A型病毒结构蛋白VP1抗体。本发明专利技术试剂盒特异性好、敏感、高效，具有良好的市场前景。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物
，更具体地，本专利技术涉及一种口蹄疫病毒结构蛋白抗体酶联免疫检测试剂盒，特别是口蹄疫A型病毒结构蛋白VP1抗体酶联免疫检测试剂盒。
技术介绍
口蹄疫(FootandMouthDisease,FMD)是由口蹄疫病毒(Foot-and-mouthdiseasevirus,FMDV)引起的以感染偶蹄动物为主的急性、热性、高度接触传染性和快速远距离传播的动物疫病,以传染性强、传播速度快、危害严重而著称(谢庆阁,2004)。世界动物卫生组织(OIE)将其列为必须通报的多种动物共患传染病之一，我国将其列为一类动物传染病。口蹄疫传染性高，传播迅速，感染猪、牛、羊等牲畜常导致幼畜死亡，成年动物生产能力急剧下降。该病传播迅速,可以引起世界性的大流行,不仅对畜牧业造成巨大的经济损失,而且严重影响动物及其产品的国际贸易和声誉。由于FMD的巨大危害性,美国权威著作《家畜传染病》早在1981年版中就声明:FMD不仅是经济性疾病,同时也是政治性疫病。口蹄疫病毒属于小核糖核酸病毒科，口蹄疫病毒属。由“假”20面体对称的衣壳和病毒核酸构成，该病毒粒子的整个外形是球形，不是严格的正20面体。完整的病毒颗粒包括衣壳和RNA两部分，衣壳由VP1,VP2，VP3和VP4等4种结构蛋白各60个分子组成。结构蛋白VP1大部分暴露在病毒粒子表面,是决定病毒抗原性的主要成分,也是刺激机体产生中和抗体的主要蛋白。4种结构蛋白中VP1变异性最大,VP2较为保守,VP4最保守。病毒衣壳蛋白的功能有:保护RNA免遭核酸酶降解；识别特异性细胞受体,决定宿主范围和组织嗜性；决定病毒的抗原性；释放和传递病毒RNAZ通过细胞膜进入易感细胞内；指导选择和包装病毒RNA。2004年OIE公布的口蹄疫血清学检测方法有3种：病毒中和试验(VNT)、液相阻断ELISA(LPB-ELISA)、固相竞争ELISA(SPC-ELISA)，其中病毒中和试验是3种方法中最为经典的方法，是评价其他方法的黄金标准。1996年，口蹄疫世界参考实验室建立了液相阻断ELISA方法，经过不断完善和健全，已成为各国大规模血清学检测的方法，用于检测动物免疫抗体、评估动物免疫状况、进行血清学调查等，该方法的敏感性、特异性和稳定性一直在国际上得到公认，是目前使用最广的口蹄疫血清学检测方法。2001年，口蹄疫世界参考实验室建立了固相竞争ELISA方法，该方法除了具有液相阻断ELISA方法的传统优势外，其特异性更好，操作更为简单(其操作时间仅为3.5h)，2004年被OIE确立为口蹄疫血清学调查的最新推荐方法。口蹄疫是关系到国家经济安全的重大动物疫病，目前,大多数发展中国家和地区都通过接种疫苗的方法来控制口蹄疫的流行。我国防控FMD主要采取疫苗免疫和抗体监测为主的综合防控政策,通过接种疫苗提高畜群整体抗体水平来预防口蹄疫的感染和传播。因此口蹄疫感染的快速诊断、猪和牛免疫效果评价、自然感染和疫苗免疫的鉴别诊断成为防控口蹄疫的部分关键技术。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种新的基于酶联免疫吸附试验，用于检测猪、牛血清中是否含有口蹄疫A型病毒结构蛋白抗体的试剂盒。本专利技术利用VP1结构蛋白,建立一种特异性、敏感性和重复性好的间接ELISA方法,为猪、牛口蹄疫免疫抗体的检测和感染抗体的诊断提供一种简便有效的新方法,为口蹄疫综合防控提供技术支持。为了达到上述目的，本专利技术首先筛选得到了性能优异的抗原表位多肽，本专利技术提供的口蹄疫A型病毒结构蛋白VP1抗原表位多肽，为序列表中序列1所示的多肽、序列表中序列2或序列表中序列3所示的多肽。更进一步的，本专利技术提供一种口蹄疫A型病毒结构蛋白VP1抗原表位多肽组合物，其有效成分为序列表中序列1所示的多肽、序列表中序列2的多肽和序列表中序列3所示的多肽中的一种或两种以上任意组合。本专利技术的口蹄疫病毒结构蛋白抗体酶联免疫检测试剂盒，包括口蹄疫A型病毒结构蛋白VP1抗原表位多肽包被的酶联反应板和酶标二抗；所述口蹄疫A型病毒结构蛋白VP1抗原表位多肽为序列表中序列1所示的多肽、序列表中序列2所示的多肽和序列表中序列3所示的多肽。本专利技术的口蹄疫病毒结构蛋白抗体酶联免疫检测试剂盒中，所述序列表中序列1所示的多肽、序列表中序列2所示的多肽和序列表中序列3所示的多肽的质量比为0.5～2.0:0.5～2.0:1，优选为1:1:1。所涉及的包被抗原采用固相化学合成的方法生产，包被抗原含有口蹄疫病毒结构蛋白VP1的主要抗原位点，可与口蹄疫病毒感染后或免疫后产生的结构蛋白VP1抗体特异结合。所述酶标二抗的标记酶为辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶；所述酶标二抗为酶标记葡萄球菌A蛋白；所述酶标二抗优选为辣根过氧化物酶标记的葡萄球菌A蛋白。所述酶联反应板为可拆卸96孔酶标板；所述口蹄疫A型结构蛋白VP1抗原表位多肽为化学人工合成得到。所述口蹄疫A型结构蛋白VP1抗原表位多肽包被的酶联反应板的板的最佳制备条件是：将所述口蹄疫A型结构蛋白VP1抗原表位多肽溶于100μl的pH9.6的碳酸盐溶液，然后加到96孔聚苯乙烯酶联反应板，每孔每肽50ng抗原，在37℃放置2～4h，再4～8℃下放置过夜，使多肽抗原与酶联反应板充分结合，然后按照300μl/孔加入含有1％(g/ml)牛血清白蛋白(BSA)的PBS缓冲液(pH＝7.4)，37℃封闭处理2～3h，用洗涤缓冲液(浓缩洗涤液用蒸馏水或去离子水20倍稀释得到洗涤缓冲液)洗涤后甩干，待酶联反应板干燥后4℃密封保存。所述试剂盒中含有显色液和终止液；当标记酶为辣根过氧化物酶时显色液由显色液A液和显色液B液组成，所述显色液A液为含0.6mg/ml过氧化氢尿素的柠檬酸磷酸盐缓冲液；所述显色液B液为0.2mg/ml的四甲基联苯胺(TMB)溶液,使用时两者以1:1的比例混合；当标记酶为碱性磷酸酶时，显色液为4-硝基酚磷酸盐缓冲液；所述终止液为2mol/L的硫酸溶液。所述试剂盒还包括阴性对照血清、阳性对照血清；所述阴性对照血清为用无口蹄疫抗体的正常猪血清；所述阳性对照血清为以所述口蹄疫A型病毒结构蛋白VP1抗原表位多肽为免疫原免疫猪得到的血清；所涉及的阳性对照血清是具体是以上述人工化学合成的包被抗原(口蹄疫A型病毒结构蛋白VP1抗原表位多肽)作为免疫原(免疫25～35日龄无特定病源体猪)制备高免血清，过0.2μm滤膜除菌，作为试剂盒的阳性对照血清。所涉及的阴性对照血清是用无口蹄疫抗体的正常猪血清，过0.22μm滤膜除菌，作为试剂盒阴性对照血清。所述试剂盒还包括样品稀释液和浓缩洗涤液；样品稀释液为含有0.5％(g/ml)酪蛋白的0.01M、pH为7.4的PBS缓冲液(过0.22μm滤膜)；浓缩洗涤液：0.01M，pH7.4，含有0.8％～1.2％(ml/ml，优选0.5％ml/ml)Tween-20和0.05％(g/ml)叠氮钠防腐剂的磷酸盐缓冲液(经过0.22μm滤膜除菌)。本专利技术试剂盒的检测程序为：1、平衡：将试剂盒从冷藏环境中取出，置室温平衡30min备用；液体试剂用前混匀。2、配液：将浓缩洗涤液用蒸馏水或去离子水20倍稀释得到洗涤缓冲液；3、设定：2个阴性对照孔和2个阳性对照孔，其余为待测样本孔。4、待测标本预稀释：使用样品稀释液将待检样品血本文档来自技高网...
【技术保护点】
口蹄疫A型病毒结构蛋白VP1抗原表位多肽，为序列表中序列1所示的多肽、序列表中序列2或序列表中序列3所示的多肽。
【技术特征摘要】
1.口蹄疫A型病毒结构蛋白VP1抗原表位多肽，为序列表中序列1所示的多肽、序列表中序列2或序列表中序列3所示的多肽。2.口蹄疫A型病毒结构蛋白VP1抗原表位多肽组合物，其有效成分为为序列表中序列1所示的多肽、序列表中序列2和序列表中序列3所示的多肽中的一种或两种以上任意组合。3.一种口蹄疫A型病毒结构蛋白抗体酶联免疫检测试剂盒，包括口蹄疫A型病毒结构蛋白VP1抗原表位多肽包被的酶联反应板和酶标二抗；所述口蹄疫A型病毒结构蛋白VP1抗原表位多肽为序列表中序列1所示的多肽、序列表中序列2所示的多肽和序列表中序列3所示多肽中的一种或几种组成的混合多肽。4.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述序列表中序列1所示的多肽、序列表中序列2所示的多肽和序列表中序列3所示的多肽的质量比为0.5～2.0:0.5～2.0:1；所述序列表中序列1所示的多肽和序列表中序列2所示的多肽和序列表中序列3所示多肽的质量比优选为1:1:1。5.根据权利要求2～4中任意一项，其特征在于：所述酶标二抗的标记酶为辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶；所述酶标二抗为酶标记葡萄球菌A蛋白；所述酶标二抗优选为辣根过氧化物酶标记的葡萄球菌A蛋白。6.根据权利要求2～4中任意一项的试剂盒，其特征在于：所述酶联反应板为可拆卸96孔酶标板；所述口蹄疫A型病毒结构蛋白VP1抗原表位多肽为化学人工合成得到。7.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于：所述口蹄疫A型病毒结构蛋白VP1抗原表位多肽包被的酶联反应板的获得方法是将所述口蹄疫A型病毒结构蛋白VP1抗原表位多肽溶于100μl的pH9.6的碳酸盐溶液，然后加到96孔聚苯乙烯...
【专利技术属性】
技术研发人员：张蕾，董春娜，王楠，肖进，齐鹏，巴利民，王振豹，张君，张艳宾，张欣，
申请(专利权)人：中牧实业股份有限公司，
类型：发明
国别省市：北京;11
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