单克隆抗体3D9识别的口蹄疫病毒血清型共享性表位及其应用制造技术

本发明专利技术公开了单克隆抗体3D9识别的口蹄疫病毒血清型共享性表位及其应用。本发明专利技术首先公开了单克隆抗体3D9识别的口蹄疫病毒血清型共享性表位，其氨基酸序列为SEQ ID NO：2所示。本发明专利技术所述口蹄疫病毒血清型共享性表位是七个血清型口蹄疫病毒的共享型表位。本发明专利技术利用筛选得到的与单克隆抗体3D9特异性结合的噬菌体克隆作为模拟抗原建立的间接ELISA方法，能够特异性的检测出口蹄疫病毒阳性血清。本发明专利技术所述单克隆抗体3D9识别的口蹄疫病毒血清型共享性表位在口蹄疫的诊断或防治中具有应用价值。

Serotype shared epitope of foot-and-mouth disease virus identified by monoclonal antibody 3D9 and its application

The invention discloses a serotype shared epitope of a foot-and-mouth disease virus identified by monoclonal antibody 3D9 and the use thereof. The present invention discloses the foot-and-mouth disease virus serotype detected by monoclonal antibody 3D9 shared epitope, the amino acid sequence of SEQ ID NO:2 shown. The serotype shared epitope of the foot-and-mouth disease virus of the present invention is a shared epitope of seven serotypes of foot-and-mouth disease virus. The present invention utilizes a screened phage clone that specifically combines with monoclonal antibody 3D9 as an indirect ELISA for establishing an analog antigen, and can specifically detect a positive serum of an infectious bovine plague virus. The serotype shared epitope of the foot-and-mouth disease virus recognized by the monoclonal antibody 3D9 has the applied value in the diagnosis and the prevention and control of foot and mouth disease.

【技术实现步骤摘要】
单克隆抗体3D9识别的口蹄疫病毒血清型共享性表位及其应用
本专利技术涉及口蹄疫病毒共享型单克隆抗体3D9识别的口蹄疫病毒血清型共享性表位，本专利技术还涉及所述口蹄疫病毒血清型共享性表位在口蹄疫诊断或防治中的应用，属于口蹄疫的防治领域。
技术介绍
口蹄疫(foot-and-mouthdisease,FMD)是由口蹄疫病毒(Footandmouthdiseasevirus,FMDV)引起的，严重危害偶蹄动物的重要传染病之一。该病引起幼畜死亡、产奶量下降、肉食减少、肉品下降、动物的生产性能降低，而且具有极强的传染性，可形成大范围流行，造成巨大的经济损失。预防和控制口蹄疫的关键是免疫接种和准确的诊断方法的应用。口蹄疫病毒(FMDV)属于小RNA病毒科口蹄疫病毒属的成员，为单股正链RNA，其基因组RNA全长约8.5kb。根据免疫原性，口蹄疫病毒有O、A、C、SAT1、SAT2、SAT3和Asial共7个血清型及65个以上的亚型，各血清型之间无交叉免疫保护。目前中国主要流行O型、A型和Asial型FMD。口蹄疫病毒的抗原结构十分复杂，不同血清型、基因型和分离株的抗原位点和抗原表位都不尽相同，存在广泛的抗原变异。利用单抗逃逸突变株序列分析和交叉中和试验，已鉴定了一些不同血清型FMDV的抗原位点，相关的研究主要来自O、A、C和Asia1型FMDV，而某些相对保守的免疫显性表位可诱导机体产生血清型共享型单抗，对于FMDV感染的诊断具有重要价值。因此，研究口蹄疫病毒共享型单克隆抗体以及鉴定该单克隆抗体所识别的口蹄疫病毒血清共享型表位，对于口蹄疫的诊断和防治等均具有重要意义。专利
技术实现思路
本专利技术所要解决的第一个技术问题是提供口蹄疫病毒共享型单克隆抗体3D9识别的口蹄疫病毒血清型共享性表位；本专利技术所要解决的第二个技术问题是将上述口蹄疫病毒血清型共享性表位应用于口蹄疫的诊断或防治。为解决上述技术问题，本专利技术所采取的技术方案是：本专利技术首先公开了一株分泌口蹄疫病毒共享型单克隆抗体3D9的杂交瘤细胞系以及由所述杂交瘤细胞系分泌的口蹄疫病毒共享型单克隆抗体3D9。本专利技术将分泌口蹄疫病毒共享型单克隆抗体3D9的杂交瘤细胞系提交专利认可的机构进行保藏，其微生物保藏编号为：CGMCCNo.13293；分类命名为：分泌FMDV共享型单克隆抗体的杂交瘤细胞株。保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏时间是2016年11月25日；保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。经IFA特异性鉴定表明，由所述杂交瘤细胞系分泌的单克隆抗体3D9为一株血清型共享性单抗，其与O型、A型和Asia1型口蹄疫病毒抗原均有反应。本专利技术以单克隆抗体3D9作为固相筛选分子，生物淘选噬菌体随机12肽库，经3轮淘选后，特异性噬菌体得到富集。随机挑取40个噬菌体，通过噬菌体ELISA和抗原竞争抑制试验，发现有7个噬菌体克隆可与单抗3D9特异性结合。提取阳性噬菌体克隆的DNA进行测序，发现阳性噬菌体克隆展示一个共有基序GVYxxAYxW(SEQIDNO：1)；其中，X为任意一种氨基酸残基。该共有基序与所有7个血清型FMDV毒株VP2蛋白的第89-105氨基酸区域具有较高的相似性。本专利技术为进一步验证单抗3D9识别的抗原表位，利用反向遗传系统拯救了VP2蛋白该表位定点诱变的重组病毒V90A，通过间接ELISA检测显示，与亲本株相比较，突变株与单抗3D9结合能力下降了50％。由此，本专利技术确定VP2的89GVYX1X2X3X4X5X6X7AYX8X9X10X11W105序列(SEQIDNO：2所示)是单抗3D9所针对的抗原表位，其中X1-X11可选择任何一种氨基酸残基；优选的X1为甘氨酸；X2为丝氨酸、谷氨酰胺、丙氨酸、甘氨酸或组氨酸；X3为亮氨酸或甲硫氨酸；X4为苏氨酸、缬氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸或谷氨酸；X5为天冬氨酸、赖氨酸或丙氨酸；X6为丙氨酸、丝氨酸或苏氨酸；X7为酪氨酸、组氨酸或苯丙氨酸；X8为甲硫氨酸、异亮氨酸或缬氨酸；X9为精氨酸；X10天冬酰胺；X11为甘氨酸。对FMDV毒株该表位肽序列进行比对分析发现，单抗3D9识别的表位在GenBank公示的O、A、C、Asia1、SAT1、SAT2和SAT3所有7个血清型FMDV毒株的VP2蛋白上是高度保守的，表明它是各血清型FMDV毒株的共享型表位。为了进一步验证单克隆抗体3D9识别的口蹄疫病毒血清型共享性表位在口蹄疫病毒诊断中的应用潜力，本专利技术利用筛选得到的噬菌体克隆9和14作为模拟抗原，建立了检测口蹄疫病毒血清抗体的间接ELISA方法，其中噬菌体的最佳包被浓度为1.56xl07pfu/ml，结果证明用噬菌体克隆9和14作为模拟抗原建立的方法能够特异性的检测出FMDV阳性血清。上述结果表明，单克隆抗体3D9识别的口蹄疫病毒血清型共享性表位在口蹄疫病毒诊断中具有应用价值。本专利技术所述口蹄疫病毒血清型共享性表位是O型、A型、C型、Asia1型、SAT1型、SAT2型和SAT3型七个血清型口蹄疫病毒的共享性表位。本专利技术进一步公开了所述的共有基序或口蹄疫病毒血清型共享性表位在制备诊断、预防或治疗口蹄疫的试剂或药物中的应用，以及在制备口蹄疫病毒抗体检测的试剂中的应用。本专利技术还公开了一种用于诊断口蹄疫病毒的间接ELISA试剂盒，包括：包被抗原的固相载体、洗涤液、封闭液、HRP标记的羊抗牛IgG抗体、显色液、终止液；其中，所述抗原为单克隆抗体3D9识别的口蹄疫病毒血清型共享性表位或单克隆抗体3D9表位模拟肽的共有基序。所述洗涤液为pH7.4的PBST溶液，所述封闭液为5％脱脂乳，所述显色液为TMB显色液。所述口蹄疫病毒包括：O型、A型、C型、Asia1型、SAT1型、SAT2型或SAT3型口蹄疫病毒。本专利技术技术方案与现有技术相比，具有以下有益效果：本专利技术对单克隆抗体3D9识别的共享性表位进行鉴定，确定FMDV毒株VP2蛋白的第89-105氨基酸区域是单抗3D9所针对的抗原表位，该表位是七个血清型FMDV毒株的共享型表位。本专利技术所述单克隆抗体3D9识别的口蹄疫病毒血清型共享性表位在口蹄疫病毒诊断或防治中具有重要应用价值。附图说明图1为ELISA方法筛选与单抗3D9特异性结合的噬菌体；其中，PL为野生型噬菌体(wild-typeM13phage)，未插入随机肽，作为阴性对照；图2为抗原竞争抑制试验；图3为FMDV毒株3D9表位的保守性分析；图4为ELISA分析表位突变病毒株与单抗3D9的结合力；图5为ELISA分析单抗3D9识别抗原表位与口蹄疫病毒抗体阳性血清的特异性反应。具体实施方式下面结合具体实施例来进一步描述本专利技术，本专利技术的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但是应理解所述实施例仅是范例性的，不对本专利技术的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本专利技术的精神和范围下可以对本专利技术技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改或替换均落入本专利技术的保护范围。实施例1单克隆抗体3D9识别的口蹄疫病毒血清共享型表位的鉴定1、材料和方法1.1病毒、细胞和菌株口蹄疫病毒O/YS/CHA/05株属于O型泛亚谱系；乳仓鼠肾细胞BHK-21为本专利技术人实验室保存；FMDVO/YS/CHA/05株感染性质粒PYS均由本专利技术人实验室保本文档来自技高网...

【技术保护点】
单克隆抗体3D9表位模拟肽的共有基序，其特征在于，其氨基酸序列为SEQ ID NO：1所示；其中，X为任意一种氨基酸残基。

【技术特征摘要】
1.单克隆抗体3D9表位模拟肽的共有基序，其特征在于，其氨基酸序列为SEQIDNO：1所示；其中，X为任意一种氨基酸残基。2.口蹄疫病毒血清型共享性表位，其特征在于，其氨基酸序列为SEQIDNO：2所示；其中，X1-X11为任意一种氨基酸残基。3.按照权利要求2所述的口蹄疫病毒血清型共享性表位，其特征在于，X1为甘氨酸G；X2为丝氨酸S、谷氨酰胺Q、丙氨酸A、甘氨酸G或组氨酸H；X3为亮氨酸L或甲硫氨酸M；X4为苏氨酸T、缬氨酸V、亮氨酸L、甲硫氨酸M或谷氨酸E；X5为天冬氨酸D、赖氨酸K或丙氨酸A；X6为丙氨酸A、丝氨酸S或苏氨酸T；X7为酪氨酸Y、组氨酸H或苯丙氨酸F；X8为甲硫氨酸M、异亮氨酸I或缬氨酸V；X9为精氨酸R；X10为天冬酰胺N；X11为甘氨酸G。4.按照权利要求2或3所述的口蹄疫病毒血清型共享性表位，其特征在于，所述口蹄疫病毒血清型共享性表位是O型、A型、C型、Asia1型、SAT1型、SAT2型和SAT3型七个血清型口蹄疫病毒的共享性...

【专利技术属性】
技术研发人员：于力，周国辉，王海伟，杨德成，
申请(专利权)人：中国农业科学院哈尔滨兽医研究所，
类型：发明
国别省市：黑龙江,23