本发明专利技术公开了一种抗蓝舌病病毒血清4型VP2蛋白的单克隆抗体，分泌该单克隆抗体的杂交瘤细胞株及用途。本发明专利技术以pET‑28a为载体构建表达的VP2‑4B蛋白作为免疫原免疫小鼠，以pMAL‑c5x为载体构建表达的VP2‑4B蛋白作为抗原，筛选阳性杂交瘤细胞，最终筛选得到一株能够稳定分泌抗BTV4‑VP2蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株，实验证明，该杂交瘤细胞株所分泌的单克隆抗体BTV4‑VP2‑1B6能够与BTV4‑VP2蛋白发生特异性反应，而与其他血清型VP2蛋白不发生反应。本发明专利技术的单克隆抗体BTV4‑VP2‑1B6为建立BTV4与其他血清型的血清学鉴别诊断方法奠定了基础。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一株杂交瘤细胞株及其分泌的单克隆抗体，尤其涉及一株分泌抗BTV4VP2蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其所分泌的单克隆抗体；本专利技术还涉及上述杂交瘤细胞株、单克隆抗体在制备诊断或预防BTV4感染检测中的应用，属于蓝舌病的防治领域。
技术介绍
蓝舌病(Bluetongue，BT)是由呼肠孤病毒科环状病毒属的蓝舌病病毒(Bluetonguevirus，BTV)引起的反当动物虫媒传染病。蓝舌病是一种急性非接触性传染病，其主要特征为以发热、白细胞减少、颊粘膜和胃肠道粘膜严重卡他性炎症。BTV能感染大多数家养的和野生的反当动物，因动物的易感性不同表现出不同的临床症状。BTV主要感染绵羊，牛等家养及野生反当类动物，反当动物感染BTV后的死亡率5％-30％不等，易感绵羊可高达80％。由于BT对世界经济的影响，世界动物卫生组织(OIE)将BT列为法定通报性疾病，我国将其划定为一类动物疫病。BT所造成的相关经济损失一方面通过直接降低动物的生产能力和增加动物的死亡率，更重要的是由于控制动物的流动、控制牛精液出口以及实施这些控制措施所需的费用而间接造成的动物贸易损失。蓝舌病病毒(Bluetongue virus，BTV)属于呼肠孤病毒科(Reoviridae)环状病毒属(Orbivirus)蓝舌病病毒亚群(Bluetongue virus subgroup)。BTV是双链RNA(dsRNA)病毒，其基因组由10个线性dsRNA片段组成，BTV总基因组约有19，200bp组成，共编码11种蛋白，包括7种结构蛋白(VP1-VP7)和4种非结构蛋白(NS1、NS2、NS3/NS3a、NS4)。BTV的内层衣壳主要由VP3蛋白组成，由L3编码，围绕着三个次要蛋白VP1、VP4、VP6和10个基因组片段构成病毒的亚核心；VP7蛋白构成BTV的中间衣壳，由S7编码，该蛋白与亚核心组分以及病毒内部其他成分共同装配成病毒的核心；VP2和VP5蛋白组成病毒的外层衣壳，分别由L2和M5编码。而四种非结构蛋白主要出现在被感染的细胞中。BTV血清型众多，目前已发现24个血清型，而随着气候变化新的血清型不断出现。然而由于各个血清型之间交叉免疫保护性差，使得疫苗免疫错综复杂不能起到很好的保护作用，到目前为止尚未有有效的可用于防治蓝舌病的疫苗。早期准确诊断，早期预防，是防止本病爆发的最有效方法。所以，必须加强我国BT的相关工作的研究，做好必要的技术储备。
技术实现思路
本专利技术目的之一是提供一株分泌抗蓝舌病病毒血清4型(Bluetonguevirus 4，BTV4)VP2蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株；本专利技术目的之二是提供一种由上述杂交瘤细胞株所分泌的单克隆抗体，该单克隆抗体可与BTV 4-VP2蛋白发生特异性反应；本专利技术目的之三是提供上述单克隆抗体在制备已检测BTV4型中的用途。本专利技术上述目的是通过以下技术方案来实现的：本专利技术以pET-28a为载体构建表达的VP2-4B蛋白作为免疫原免疫小鼠，取免疫后的小鼠脾淋巴细胞与SP2/0细胞融合。此外，本专利技术还以pMAL-c5x为载体构建表达的VP2-4B蛋白作为包被抗原，经间接ELISA方法筛选得到一株稳定分泌抗BTV4-VP2蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株，命名为杂交瘤细胞株1B6，分类命名是杂交瘤细胞株1B6；保藏在中国典型培养物保藏中心，地址在武汉大学，其微生物保藏号为：CCTCC No.C2016107，保藏时间为2016年7月1日。本专利技术还提供了一种由上述杂交瘤细胞株所分泌的单克隆抗体，命名为BTV4-VP2-1B6，经鉴定该单克隆抗体BTV4-VP2-1B6为IgG1亚型，轻链为Kappa链。Western blot检测结果表明BTV4-VP2-1B6可与BTV4-VP2蛋白发生特异性反应，而与SP2/0细胞不发生反应。进一步的，本专利技术还提出了所述杂交瘤细胞株以及由其分泌的单克隆康体在制备检测BTV4病毒试剂中的用途。综上所述，本专利技术制备并鉴定出了一种特异性针对BTV4-VP2蛋白的单克隆抗体，本专利技术的单克隆抗体为建立BTV4型特异性免疫学检测方法研究奠定了基础。附图说明图1为pET-28a-4A、pET-28a-4B和pET-28a-4C的鉴定结果；1.Trans2K PlusⅡDNA Marker；2.pET-28a-4A质粒；3.pET-28a-4A经BamH Ⅰ单酶切；4.pET-28a-4A经BamH Ⅰ和Xho Ⅰ双酶切；5.pET-28a-4B质粒；6.pET-28a-4B经BamH Ⅰ单酶切；7.pET-28a-4B经BamH Ⅰ和Xho Ⅰ双酶切；8.pET-28a-4C质粒；9.pET-28a-4C经BamH Ⅰ单酶切；10.pET-28a-4C经BamH Ⅰ和XhoI双酶切；图2为pMAL-c5x-4A、pMAL-c5x-4B和pMAL-c5x-4C的鉴定结果；1.Trans2K PlusⅡDNA Marker；2.pMAL-c5x-4A质粒；3.pMAL-c5x-4A经Sal Ⅰ单酶切；4.pMAL-c5x-4A经Sal Ⅰ和Not Ⅰ双酶切；5.pMAL-c5x-4B质粒；6.pMAL-c5x-4B经Sal Ⅰ单酶切；7.pMAL-c5x-4B经Sal Ⅰ和EcoR Ⅰ双酶切；8.pMAL-c5x-4C质粒；9.pMAL-c5x-4C经Sal Ⅰ单酶切；10.pMAL-c5x-4C经Sal Ⅰ和EcoR Ⅰ双酶切；图3为重组His-4B蛋白的SDS-PAGE分析结果；1.pET-28a-4B/BL21诱导前；2.pET-28a-4B/BL21诱导后；3.蛋白质分子量标准；图4为重组MBP-4B蛋白的SDS-PAGE分析结果；1.蛋白质分子量标准；2.pMAL-c5x-4B/BL21诱导前；3.pMAL-c5x-4B/BL21诱导后；图5为His-4B纯化蛋白与His标签单抗的Western blot分析结果；1.His-4B纯化蛋白；2蛋白质分子量标准；图6为本专利技术的单克隆抗体1B6与BTV4-VP2-A、BTV4-VP2-B以及BTV4-VP2-C的Western blot分析结果。1.BTV4-VP2-A；2.BTV4-VP2-B；3：BTV4-VP2-C；4.蛋白质分子量标准。具体实施方式下面结合具体实施例来进一步描述本专利技术，本专利技术的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本专利技术的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本专利技术的精神和范围下可以对本专利技术技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本专利技术的保护范围内。本专利技术实施例中涉及的主要实验材料和来源：1、主要试剂和药品各种限制性内切酶、T4连接酶、反转录酶、Taq酶、DNA marker均为宝生物工程(大连)有限公司产品；质粒小量抽提试剂盒购AXYGE公司；胶回收小量试剂盒购自中科瑞泰有限公司；辣根过氧化物酶(HRP)标记羊抗鼠IgG购自北京中杉金桥生物技术有限公司；邻苯二胺(OPD)购自SIGMA公司；胎牛血清均购自GIBCO公司；特级胎牛血清购自天津灏阳公司；1640基础培养基、二甲基亚砜(DMSO)、胰蛋白酶、PEG3350、本文档来自技高网...
【技术保护点】
一株稳定分泌抗BTV4‑VP2蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株，命名为杂交瘤细胞株1B6，其特征在于，所述的杂交瘤细胞株保藏在中国典型培养物保藏中心，地址在武汉大学，其微生物保藏号为：CCTCC No.C2016107。
【技术特征摘要】
1.一株稳定分泌抗BTV4-VP2蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株，命名为杂交瘤细胞株1B6，其特征在于，所述的杂交瘤细胞株保藏在中国典型培养物保藏中心，地址在武汉大学，其微生物保藏号为：CCTCC No.C20...
【专利技术属性】
技术研发人员：唐丽杰，李一经，徐义刚，王丽，乔薪瑗，刘敏，刘琦，李佳璇，臧明鑫，
申请(专利权)人：东北农业大学，
类型：发明
国别省市：黑龙江;23
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