本发明专利技术公开了一种微载体悬浮培养BHK21细胞生产口蹄疫种毒的方法，其包括以下步骤：将BHK21细胞复苏，方瓶贴壁培养，再经过消化放大转瓶培养；BHK21细胞贴壁逐步扩大培养，至反应器所需细胞密度；反应器加入处理过的微载体，微载体用量为1‑5g/L；BHK21细胞消化接入反应器微载体培养，取样消化计数密度达到1‑4×109个/L，接毒1‑5％，细胞活力≤5％，收获培养液，低温冷藏备用；微载体反应器收毒后，检测LD50。本发明专利技术具有自动化程度高、种毒毒价高、种毒一致性好，且产量大的特点，并且解决了口蹄疫种毒生产中产品质量稳定性差和产量低的问题。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及细胞培养领域，具体涉及一种微载体悬浮培养BHK21细胞生产口蹄疫种毒的方法。
技术介绍
制备种毒是疫苗生产的重要工艺环节。目前制备疫苗种毒的方法包括转瓶工艺生产和悬浮工艺生产两种：转瓶工艺制备种毒，质量稳定，毒价较好但操作繁琐，消耗大量人工，单位产量小，内毒素难以控制；悬浮工艺可大规模生产疫苗种毒，操作相对简便，但毒价较低，难以达到理想效果。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服现有技术存在的以上问题，提供微载体悬浮培养BHK21细胞生产口蹄疫种毒的方法，本专利技术采用生物反应器微载体培养疫苗种毒，生物反应器微载体培养病毒疫苗种毒，具有自动化程度高、种毒毒价高、种毒一致性好，且产量大的特点。为实现上述技术目的，达到上述技术效果，本专利技术通过以下技术方案实现：一种微载体悬浮培养BHK21细胞生产口蹄疫种毒的方法，其包括以下步骤：S101将BHK21细胞复苏，方瓶贴壁培养，再经过消化放大转瓶培养；S102BHK21细胞贴壁逐步扩大培养，至反应器所需细胞密度；S103反应器加入处理过的微载体，微载体用量为1-5g/L；S104BHK21细胞消化接入反应器微载体培养，取样消化计数密度达到1-4×109个/L，接毒1-5％，细胞活力≤5％，收获培养液，低温冷藏备用；S105微载体反应器收毒后，检测LD50。进一步包括，S101中，BHK21细胞经过复苏后，使用MEM+8％新生牛血清培养基进行铁壁培养，并经过胰酶消化放大至转瓶培养。进一步包括，S102中，细胞计数，1.8-7×108/L细胞量接种于5L生物反应器中。进一步包括，S103中，控制反应器的条件：36-38℃，pH6.8-7.2，DO20-50％，接种48h后，取样，结晶紫染色进行细胞计数。进一步包括，S104中，BHK21细胞在反应器悬浮扩大培养的步骤包括：S2015L反应器中，当细胞密度达到1-4×109/L时，沉降微载体，排出培养基，使用PBS洗涤，每次2L，洗涤2次，加入胰酶消化液，边搅拌边消化，确定达到消化效果后，加入含血清培养基终止胰酶消化，并转入100L反应器中；S202100L反应器中含微载体1-5g/L，培养体积70-100L,控制反应器条件：36-38℃，pH6.8-7.2，DO20-50％，在以上条件下，进行培养,并在接种48h后，取样，结晶紫染色进行细胞计数,计算细胞生长状态,当细胞密度达到1-4×109/L时，以同样操作方式消化并接种至500L反应器；S203500L反应器中含微载体1-5g/L，培养体积300-500L，控制反应器条件：36-38℃，pH6.8-7.2，DO20-50％，在以上条件下，进行培养,并在接种48h后，取样，结晶紫染色进行细胞计数,计算细胞生长状态,当细胞密度达到1-4×109/L时，以0.5-2％接种口蹄疫种毒。进一步包括，S105中，在500L反应器中接种种毒后，设定反应器的条件为36-38℃，pH为7.2-7.5，DO20-50％，进行种毒增毒，定时取样观察，当明显出现细胞病变时，收货增毒产物，置于-20--80℃冷冻保存，对产物进行LD50检测，LD50达到10^–7～–7.75/0.2ml。进一步包括，步骤S101-105用于生产任何口蹄疫疫苗种毒。进一步包括，步骤S101-105用于生产任何亚型口蹄疫疫苗种毒。本专利技术的有益效果是:本专利技术的方法易于操作控制，具有自动化程度高、种毒毒价高、种毒一致性好，且产量大的特点，并且解决了口蹄疫种毒生产中产品质量稳定性差和产量低的问题。上述说明仅是本专利技术技术方案的概述，为了能够更清楚了解本专利技术的技术手段，并可依照说明书的内容予以实施，以下以本专利技术的较佳实施例并配合附图详细说明如后。本专利技术的具体实施方式由以下实施例及其附图详细给出。附图说明为了更清楚地说明本专利技术实施例技术中的技术方案，下面将对实施例技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本专利技术的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。图1是本专利技术的方法流程图。具体实施方式下面将结合本专利技术实施例中的附图，对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本专利技术保护的范围。实施例参照图1所示，本实施例中公开了一种微载体悬浮培养BHK21细胞生产口蹄疫种毒的方法，其包括以下步骤：S101BHK21细胞经过复苏后，使用MEM+8％新生牛血清培养基进行铁壁培养，并经过胰酶消化放大至转瓶培养。S102BHK21细胞贴壁逐步扩大培养，至反应器所需细胞密度，细胞计数，1.8-7×108/L细胞量接种于5L生物反应器中。S103反应器加入处理过的微载体，微载体用量为1-5g/L；其中，控制反应器的条件：36-38℃，pH6.8-7.2，DO20-50％，接种48h后，取样，结晶紫染色进行细胞计数。S104BHK21细胞消化接入反应器微载体培养，取样消化计数密度达到1-4×109个/L，接毒1-5％，细胞活力≤5％，收获培养液，低温冷藏备用。S104中，BHK21细胞在反应器悬浮扩大培养的步骤包括：S2015L反应器中，当细胞密度达到1-4×109/L时，沉降微载体，排出培养基，使用PBS洗涤，每次2L，洗涤2次，加入胰酶消化液，边搅拌边消化，确定达到消化效果后，加入含血清培养基终止胰酶消化，并转入100L反应器中；S202100L反应器中含微载体1-5g/L，培养体积70-100L,控制反应器条件：36-38℃，pH6.8-7.2，DO20-50％，在以上条件下，进行培养,并在接种48h后，取样，结晶紫染色进行细胞计数,计算细胞生长状态,当细胞密度达到1-4×109/L时，以同样操作方式消化并接种至500L反应器；S203500L反应器中含微载体1-5g/L，培养体积300-500L，控制反应器条件：36-38℃，pH6.8-7.2，DO20-50％，在以上条件下，进行培养,并在接种48h后，取样，结晶紫染色进行细胞计数,计算细胞生长状态,当细胞密度达到1-4×109/L时，以0.5-2％接种口蹄疫种毒。S105在500L反应器中接种种毒后，设定反应器的条件为36-38℃，pH为7.2-7.5，DO20-50％，进行种毒增毒，定时取样观察，当明显出现细胞病变时，收货增毒产物，置于-20--80℃冷冻保存，对产物进行LD50检测，如表1中所示，LD50达到10^–7～–7.75/0.2ml。上述步骤S101-105用于生产任何口蹄疫疫苗种毒，或生产任何亚型口蹄疫疫苗种毒。表1转瓶种毒和悬浮种毒参数比较上述方法易于操作控制，具有自动化程度高、种毒毒价高、种毒一致性好，且产量大的特点，并且解决了口蹄疫种毒生产中产品质量稳定性差和产量低的问题。对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本专利技术。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本专利技术的精神或范围的本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种微载体悬浮培养BHK21细胞生产口蹄疫种毒的方法，其特征在于，其包括以下步骤：S101将BHK21细胞复苏，方瓶贴壁培养，再经过消化放大转瓶培养；S102 BHK21细胞贴壁逐步扩大培养，至反应器所需细胞密度；S103反应器加入处理过的微载体，微载体用量为1‑5g/L；S104 BHK21细胞消化接入反应器微载体培养，取样消化计数密度达到1‑4×109个/L，接毒1‑5％，细胞活力≤5％，收获培养液，低温冷藏备用；S105微载体反应器收毒后，检测LD50。
【技术特征摘要】
1.一种微载体悬浮培养BHK21细胞生产口蹄疫种毒的方法，其特征在于，其包括以下步骤：S101将BHK21细胞复苏，方瓶贴壁培养，再经过消化放大转瓶培养；S102BHK21细胞贴壁逐步扩大培养，至反应器所需细胞密度；S103反应器加入处理过的微载体，微载体用量为1-5g/L；S104BHK21细胞消化接入反应器微载体培养，取样消化计数密度达到1-4×109个/L，接毒1-5％，细胞活力≤5％，收获培养液，低温冷藏备用；S105微载体反应器收毒后，检测LD50。2.根据权利要求1所述的微载体悬浮培养BHK21细胞生产口蹄疫种毒的方法，其特征在于，S101中，BHK21细胞经过复苏后，使用MEM+8％新生牛血清培养基进行铁壁培养，并经过胰酶消化放大至转瓶培养。3.根据权利要求1所述的微载体悬浮培养BHK21细胞生产口蹄疫种毒的方法，其特征在于，S102中，细胞计数，1.8-7×108/L细胞量接种于5L生物反应器中。4.根据权利要求1所述的微载体悬浮培养BHK21细胞生产口蹄疫种毒的方法，其特征在于，S103中，控制反应器的条件：36-38℃，pH6.8-7.2，DO20-50％，接种48h后，取样，结晶紫染色进行细胞计数。5.根据权利要求1所述的微载体悬浮培养BHK21细胞生产口蹄疫种毒的方法，其特征在于，S104中，BHK21细胞在反应器悬浮扩大培养的步骤包括：S2015L反应器中，当细胞密度达到1-4×109/L时，沉降微载体，排出培养基，使用PBS洗涤，每次2L，洗涤2次，加入胰酶消化液，边搅拌边消化，确定...
【专利技术属性】
技术研发人员：王建超，苟晨，赵子威，
申请(专利权)人：天信和苏州生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32
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