本发明专利技术公开一株猪流行性腹泻病毒变异毒株及其分离培养方法和应用，属于病毒微生物技术领域。所述猪流行性腹泻病毒变异毒株命名为PEDV CH/GX/2015 /750A，保藏在中国典型培养物保藏中心，菌种保藏编号为CCTCC NO:V201646。采用本发明专利技术分离的猪流行性腹泻病毒变异毒株可以制备防治猪流行性腹泻的灭活疫苗，该灭活疫苗能有效预防猪流行性腹泻病。本发明专利技术为目前猪流行性腹泻病毒变异毒株所造成的猪流行性腹泻疾病提供有效的防治手段。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及病毒微生物
，属于兽用生物制品领域，具体涉及一株猪流行性腹泻病毒变异毒株、其分离培养方法和在制备防治猪流行性腹泻灭活疫苗中的应用。
技术介绍
猪流行性腹泻病毒（porcineepidemicdiarrheavirus，PEDV）是猪流行性腹泻（porcineepidemicdiarrhea，PED）的致病病原。猪流行性腹泻是一种高度传染的猪肠道传染病，该病以急性水样腹泻、呕吐和脱水死亡为主要特征；各种年龄阶段的猪只均易感，对1～2周龄内的哺乳仔猪危害最为严重，病死率可高达90%～100%，给养猪业造成了严重的危害和经济损失。20世纪70年代，英国和比利时各自率先报道了该病的发生，随后该病在加拿大、匈牙利、德国等欧美多个养猪国家相继被报道；20世纪80～90年代，PED开始出现在亚洲一些养猪国家，并且多次反复的发生PED疫情，如日本、韩国和中国均多次报道了PED。2010年以来，PED在我国的猪群中重新出现，且大范围暴发流行，表现为高发病率和高死亡率的哺乳仔猪腹泻（病死率达80%～100%），造成了数百万的哺乳仔猪死亡。2013年5月以来美国猪群暴发PED疫情，并迅速波及到整个美国和相邻的墨西哥、加拿大等国家，在随后的一年内造成约800万的哺乳仔猪死亡，经济损失在9～18亿美元之间。PEDV与猪传染性胃肠炎病毒（TGEV）、猪呼吸道冠状病毒（PRCV）同属于甲型冠状病毒属（Alphacoronavirus）的成员，为有囊膜的单股正链RNA病毒。PEDV基因组全长约28kb，包括5’端非编码区、3’端非编码区以及至少7个开放阅读框（ORF1a,ORF1b,ORF2~6），分别编码主要结构蛋白：纤突蛋白（S）、膜蛋白（M）、核衣壳蛋白（N）、小包膜蛋白（E）和非结构蛋白（复制酶1a、1b、ORF3蛋白）。S蛋白为I型跨膜蛋白，位于病毒粒子的表面，它在诱导感染宿主中和抗体的产生、与特异性受体的结合及细胞膜融合方面发挥着十分重要的作用。此外，冠状病毒S基因的变异可以引起病毒组织嗜性的改变和病毒毒力的变化。M蛋白在病毒粒子的组装过程中起着重要的作用，其诱导的抗体在有补体存在的情况下具有中和病毒的作用。N蛋白与病毒的基因组RNA结合形成螺旋型的核蛋白，在病毒感染细胞过程中产量最高的蛋白，是病毒诱导机体免疫的主要优势抗原。ORF3基因是PEDV的一个附属基因，编码一种离子通道蛋白，可调节病毒产量，可能与病毒的毒力有关。在细胞中分离培养PEDV是开发灭活疫苗或者弱毒疫苗用于防控PED的第一步工作，同时病毒的成功分离培养也是开展病毒学研究和免疫学研究的基础。利用细胞培养进行PEDV的分离是比较困难的，病毒分离受到许多因素的影响，如样品的类型、样品中病毒的滴度、样品中的物质及毒株属性等，即使是从临床样品中分离到了病毒但在传代培养的过程可能会逐渐丧失感染性。
技术实现思路
本专利技术的目的提供一株猪流行性腹泻病毒的变异毒株及其分离培养方法和应用。本专利技术分离的猪流行性腹泻病毒变异毒株经过序列测定，表明该变异毒株同国内外早期毒株和经典疫苗株均存在差异，利用该变异毒株制备的灭活疫苗免疫母猪后对所产仔猪能够起到很好的保护作用。为实现本专利技术目的所使用的技术方案为：一株猪流行性腹泻病毒变异毒株，所述猪流行性腹泻病毒变异毒株命名为PEDVCH/GX/2015/750A，保藏在中国典型培养物保藏中心（CCTCC），菌种保藏编号为CCTCCNO:V201646。所述猪流行性腹泻病毒变异毒株的保藏信息如下：分类命名：猪流行性腹泻病毒PEDVCH/GX/2015/750A保藏单位：中国典型培养物保藏中心（CCTCC）保藏地址：中国武汉武汉大学保藏日期：2016年8月17日所述猪流行性腹泻病毒变异毒株的核苷酸序列如SEQIDNO：1所示。一种猪流行性腹泻病毒的分离方法，具体步骤如下：1）将腹泻仔猪的粪便或肠道内容物用RT-PCR检测为PEDV阳性的样品用浓度为0.01mol/L，pH为7.2PBS制成1:10的悬液，涡旋震荡混匀，4℃条件下12000r/min离心30min，取上清用0.22μm的滤器进行过滤后接种至Vero细胞；2）将生长状态良好、融合度在75%-85%的Vero细胞用PBS洗涤两次，后将其用于病毒分离；3）将1mL经过滤的PEDV阳性悬液加到T25细胞瓶中，在5%CO2、37℃环境中温育90min，每15min摇动一次；弃去接种物，加入含有100units/mL青霉素、100μg/mL链霉素、0.3%胰蛋白示磷酸肉汤及10μg/mL胰酶的DMEM培养基；培养3d~7d，期间每天观察有无CPE产生；若无CPE产生则在接种7d后冻融细胞2后，收集细胞和培养液进行下一代的接毒培养，盲传至第10代仍无CPE出现则弃去；若接种的Vero单层细胞有CPE出现，则在90%的细胞有CPE时，将细胞冻融2次后收集细胞和培养液并继续传代培养；收集的每代细胞培养物进行RT-PCR扩增鉴定；其中RT-PCR扩增鉴定的引物序列为PEDV-P5：5’-gaaataaccagggtcgtgga-3’和PEDV-P6：5’-gctcacgaacagccacatta-3’。4）取已长成良好铺满单层的Vero细胞96孔细胞培养板，弃去细胞培养液，并用PBS洗涤两次；将分离毒株第5、10、15、20和25代Vero细胞培养物用含有100units/mL青霉素、100μg/mL链霉素、0.3%胰蛋白示磷酸肉汤及10μg/mL胰酶的无血清DMEM培养基作10倍系列稀释，分别将10-1~10-10稀释度病毒液接种到96孔细胞培养板的1~10列，每个稀释度接种8孔，每孔接种100μL，同时设11、12列为细胞对照，用DMEM培养基为阴性对照；将培养板置于37℃、体积分数为5%CO2培养箱中培养120h，逐日观察CPE并记录；病毒滴度按Reed-Muench法计算，以半数组织培养感染剂量（TCID50）/mL来表示。一种如以上所述猪流行性腹泻病毒变异毒株在制备防治猪流行性腹泻灭活疫苗中的应用。本专利技术的有益效果为：本专利技术通过在Vero细胞培养基中加入胰酶的方法，从PEDV阳性的53份临床样品中分离到1株PEDV，已在连续25代细胞培养中稳定增殖，出现稳定的典型的CPE，病毒滴度随着代次的增加不断提高并且稳定在至少7.50log10TCID50/mL。获得可以稳定有效生长和增殖的PEDV分离株为病毒学研究和免疫学研究奠定了基础，为PEDV弱毒疫苗或灭活疫苗的开发提供了毒株来源，对该病的防控研究有重大的意义。本专利技术验证了在所有的样品类型中，PEDV阳性的肠道内容物可能是病毒分离的最佳材料，先前报道的分离毒株绝大多数是从自然感染或实验接种猪的肠道内容物中分离出来的；粪便样品是病毒分离主要样品来源，但其病毒分离成功率远低于肠道内容物；从血清等样品进行病毒分离的尝试并没有获得成功。附图说明图1是实施例2细胞病变图，其中a是第4代PEDV出现的细胞病变，b是对照细胞形态。图2是实施例2PEDVCH/GX/2015/750A分离毒株不同代次的病毒滴度图，其中P5、P10、P15、P20、P25分别表示第5、10、15、20、25代本文档来自技高网...
【技术保护点】
一株猪流行性腹泻病毒变异毒株，其特征在于，所述猪流行性腹泻病毒变异毒株命名为PEDV CH/GX/2015 /750A，保藏在中国典型培养物保藏中心（CCTCC），菌种保藏编号为CCTCC NO:V201646。
【技术特征摘要】
1.一株猪流行性腹泻病毒变异毒株，其特征在于，所述猪流行性腹泻病毒变异毒株命名为PEDVCH/GX/2015/750A，保藏在中国典型培养物保藏中心（CCTCC），菌种保藏编号为CCTCCNO:V201646。2.根据权利要求1所述的猪流行性腹泻病毒变异毒株，其特征在于，所述猪流行性腹泻病毒变异毒株的核苷酸序列如SEQIDNO：1所示。3.一种猪流行性腹泻病毒的分离方法，其特征在于，具体步骤如下：1）将腹泻仔猪的粪便或肠道内容物检测为PEDV阳性的样品用PBS制成1:10的悬液，涡旋震荡混匀，4℃条件下12000r/min离心30min，取上清用0.22μm的滤器进行过滤后接种至Vero细胞；2）将生长状态良好、融合度在75%-85%的Vero细胞用PBS洗涤两次，后将其用于病毒分离；3）将1mL经过滤的PEDV阳性悬液加到T25细胞瓶中，在5%CO2、37℃环境中温育90min，每15min摇动一次；弃去接种物，加入DMEM培养基；培养3d~7d，期间每天观察有无CPE产生；接种的Vero单层细胞有CPE出现时，在90%的细胞有CPE时，将细胞冻融2次后收集细胞和培养液并继续传代培养；收集的每代细胞培养物进行RT-PCR扩增鉴定；4）取已长成良好铺满单层的Vero细胞96孔细胞培养板，弃去细胞培养液，并用PBS洗涤两次；将分离毒株第5、10、15、20和25代Vero细胞培养物用无血清DMEM培养基作10倍系列稀释...
【专利技术属性】
技术研发人员：卢冰霞，秦毅斌，段群棚，赵武，周英宁，蒋冬福，陈忠伟，闭炳芬，李斌，梁家幸，何颖，苏乾莲，卢敬专，杨思仪，
申请(专利权)人：广西壮族自治区兽医研究所，
类型：发明
国别省市：广西;45
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。