本发明专利技术属于生物技术领域，具体涉及到一种O型口蹄疫病毒多肽与荷包猪SLA-2重链、轻链β2m复性、结晶的方法。本发明专利技术以荷包猪为例，构建SLA-2胞外部区原核表达载体，转入宿主菌获得表达蛋白及其包涵体，通过稀释复性法使SLA-2、Hu62多肽与sβ2m体外正确结合折叠，再利用分子筛分离纯化复性蛋白质。本发明专利技术采用了原核表达系统，高表达了荷包猪的SLA I分子的重链胞外区域和轻链，具有快捷、直观等优点，SLA-2-HB-Hu62-sβ2m结果获得高质量的单晶，晶体分辨率达到，SLA-2-HB-Hu62-sβ2m呈现非对称的双分子结构，揭示其可能有两种构象。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物
，具体涉及到一种0型口蹄疫病毒多肽与荷包猪SLA-2重 链、轻链Km复性、结晶的方法。
技术介绍
主要组织相容性复合体(majorhistocompatibilitycomplex，MHC)，简称MHC，是 脊椎动物所具有的与免疫应答相关的一类基因群。MHC分为I，II和III类。其中，MHCI类分 子与细胞免疫应答有关，这是由MHCI类分子特殊的空间结构决定的。从上世纪八十年代开 始，人们逐渐开始了对MHCI类分子晶体结构的研究。人的MHC，亦称为人的白细胞抗原（humanleukocyteantiger^HLAhigS?年，Bjorkman等(Nature，1987,6139:506-512)首次解析了人的HLA-A2的三维晶体结构，MHCI 由重链α和轻链β2微球蛋白组成。重链α包括胞外区、跨膜区和胞内区，其中胞外区部分由3 个结构域组成:α1、α2和α3,每个结构域包含大约有90个氨基酸;跨膜区的结构域由大约25 个疏水氨基酸构成，带有一段带电的亲水氨基酸;胞内锚定的部分由30个氨基酸残基组成。 其中，α?与α2具有相似的三级结构，α3与β2πι具有相似的折叠。β2πι以99个氨基酸的折叠与α 链通过非共价键结合，无跨膜区。MHCI类分子中的α3与β2πι靠近细胞膜，α3通过它的疏水跨 膜部分和亲水的胞内部分镶嵌在细胞膜内。α?与α2形成整个分子的顶部，螺旋状结构域指 向胞外，用于被TCR识别。 猪的MHC又称猪白细胞抗原（swineleukocyteantigen，SLA)，其基因组区域只有 1 · 1Mb，是目前已知最小的哺乳动物MHC基因连锁群(Renard，etal.，Genomic，2006，88:96-lOOhSLA位于猪的7号染色体上，分为classI、classII和classIII三类区域基因。II类 区域基因位于长臂上，I和III类区域基因位于短臂上，分别靠近端粒和着丝粒。SLA-2基因是猪SLA-Ι类分子重要的基因座，与SLA-l，SLA-3-起构成I类分子的3 个典型的功能基因群。张念之等(JVirol,2011,22:11709-11724)最近解析了猪SLA-1*0401晶体结构。 该研究中，SLA-1*0401和流感多肽S-0IV-NA449-457(NSDTVGWSW)及埃博拉病毒多肽Ebola virus-vp35155-163(ATAAATEAY)成功获得晶体。然而，到目前为止，猪SLA-2的晶体结构还未见报道。尤其缺乏口蹄疫病毒多肽与 SLAI类分子形成晶体的研究。课题组长期研究猪SLAI类分子，并专注于口蹄疫病毒表位 的设计和筛选。在前期研究的基础上，以实验室构建的荷包猪SLA-2重链和i32m轻链为蛋白， 与一优化筛选出的〇型口蹄疫病毒多肽表位在体外进行复性，并获得晶体，解析SLA-2晶体 结构，为今后更加准确设计猪源病毒多肽表位提供科学依据。
技术实现思路
本专利技术的目的是:研究猪SLA-2与i32m与多肽形成的复合体空间结构，解析SLA-2空 间结构，为今后详细研究SLA-2的抗原递呈功能提供了依据。本专利技术的技术方案为：以荷包猪为例，构建SLA-2胞外部区原核表达载体，转入宿 主菌获得表达蛋白及其包涵体(SLA-2-HB)。利用netMHCpan2.8设计与SLA-2-HB匹配的口蹄 疫病毒流行毒株多肽，与重链SLA-2-HB、轻链si32m成熟肽按照摩尔比3:1:1通过稀释复性法 进行共结合，通过分子筛检测。分离复性蛋白质复合物并浓缩，调整复合物浓度分别为 7.5mg/mL和1Omg/mL的浓度，在晶体生长液中进行晶体的生长。结果显示，SLA-2-HB表达蛋 白大小约为33kDa，在si32m存在的情况下，能够与0型口蹄疫多肽Hu62成功复性。当晶体浓度 为1Omg/mL的时候，用HamptonResearch试剂盒筛选出现高质量的晶体，分辨率为2.5.Αβ.晶 体经解析后分析显示，SLA-2-HB-Hu62-si32m呈现双分子的构型，进一步分析揭示造成这种 构象差异的主要是在第二位和第四位氨基酸的折叠存在差异，具体步骤如下。 1、引物设计与合成 依据荷包猪SLA-2全基因编码序列，分别设计扩增其胞外区的上游引物和下游引 物： 2、多肽的合成 通过预测网站NetMHC2.8Server以0型 口蹄疫（Foot-and-mouthdisease，FMDV) 病毒毒株HQ116229-FMDV-0-HuBHK99的全序列，设计了Hu62 口蹄疫病毒多肽，序列为： ALLRTATYY。 3、SLA-2-HB胞外区表达载体的构建 用pHB21F/pHB-21Rl作为引物对，以荷包猪SLA-2-HB01/pMD18-T全基因重组质粒 为模板，扩增荷包猪SLA-2胞外区部分，PCR产物5'端带有NdeI限制性酶切位点CA/TATG，3' 端带有XhoI限制性酶切位点CT/CGAG。建立如下PCR反应体系，总体积为50yL:PCR反应条件为 PCR产物经切胶回收，并经过NdeI和XhoI双酶切后，与经过同样酶切回收处理的 pET-21a(+ )空载体进行连接，转化BL21感受态细胞，挑取阳性克隆培养，提取质粒进行双酶 切鉴定筛选阳性克隆，并测序。 4、诱导表达、包涵体提取及SDS-PAGE电泳检测表达蛋白测序正确的SLA-2重链阳性克隆菌与轻链si32m表达菌在有Amp抗性的固体LB平板 上划线，平板在37°C培养12小时，挑取单菌落至装有3mLLB+3yLAmp(100mg/mL)培养基的试 管中培养1 〇h，把培养好的菌液50yL接入装有50mLLB液体培养基的锥形瓶内，培养基内加 入50yL的Amp，锥形瓶37°C恒温振荡过夜培养。用大三角瓶配制2L的LB液体培养基，121°C 20min灭菌。将过夜培养的菌往大三角瓶内按1:100的比例接种，并加入2mL(100mg/mL)的 Amp。在大摇床内37°C恒温震荡培养约2个小时测0D值，直至0D为0.5时加入2mL的IPTG (lmol/L)进行诱导，37°C培养5h后收菌。将培养的菌转入500mL的离心杯中，4°C，6000rpm， 15min收菌，倒掉上清只留菌体沉淀。收菌后(接下去步骤都在低温下进行），用60ml左右IX PBS悬浮(60μ1DTT，1%〇)，超声裂解(超6S，间隔12S，99+99次，250W左右）。中间看是否有沉 淀，有则搅拌，之后超声。16000rpm，15min，4°C，用玻棒将细菌碎片拨掉，washingbuffer (共100mL+100yLDTT，l%〇)洗3次。每次超声:43，103,25次，2501左右，超声条件可以自行调 整。每次超声后16000rpm，15min，washingbuffer洗涤，尽量去除细菌碎片。称重。 16000rpm，15min，resuspensionbuffer(60mL+60yLDTT，1%。）悬浮。16000rpm，15min，按 30mg/ml用dissolutionbuffer(按1 %加入DTT)溶解，4°C搅拌溶解（过夜）。16000rpm， 15min，倒出上清或分装成lml/本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种O型口蹄疫病毒多肽与荷包猪SLA‑2重链、轻链β2m复性、结晶的方法，其特征在于，具体步骤如下：(1)、引物设计与合成依据荷包猪SLA‑2全基因编码序列，分别设计扩增其胞外区的上游引物和下游引物：(2)、多肽的合成以O型口蹄疫病毒毒株HQ116229‑FMDV‑O‑HuBHK99的全序列，设计了Hu62口蹄疫病毒多肽，序列为ALLRTATYY；(3)、SLA‑2‑HB胞外区表达载体的构建用pHB21F/pHB‑21R1作为引物对，以荷包猪SLA‑2‑HB01/pMD18‑T全基因重组质粒为模板，扩增荷包猪SLA‑2胞外区部分，PCR产物5′端带有Nde I限制性酶切位点CA/TATG，3′端带有Xho I限制性酶切位点CT/CGAG，建立如下PCR反应体系，总体积为50μL：PCR反应条件为PCR产物经切胶回收，并经过Nde I和Xho I双酶切后，与经过同样处理的pET‑21a(+)空载体进行连接，转化BL21感受态细胞，挑取阳性克隆培养，提取质粒进行双酶切鉴定筛选阳性克隆，并测序；(4)、诱导表达、包涵体提取及SDS‑PAGE电泳检测表达蛋白测序正确的SLA‑2重链阳性克隆菌与轻链sβ2m表达菌在有Amp抗性的固体LB平板上划线，平板在37℃培养12小时，挑取单菌落至装有3mL LB+3μLAmp(100mg/mL)培养基的试管中培养10h，把培养好的菌液50μL接入装有50mL LB液体培养基的锥形瓶内，培养基内加入50μL的Amp，锥形瓶37℃恒温振荡过夜培养，用大三角瓶配制2L的LB液体培养基，121℃20min灭菌，将过夜培养的菌往大三角瓶内按1:100的比例接种，并加入2mL、100mg/mL的Amp，在大摇床内37℃恒温震荡培养约2个小时测OD值，直至OD为0.5时加入2mL、1mol/L的IPTG进行诱导，37℃培养5h后收菌，将培养的菌转入500mL的离心杯中，4℃，6000rpm，15min收菌，倒掉上清只留菌体沉淀，收菌后，在低温下，用60ml左右1×PBS悬浮60μl DTT，1‰，超声裂解，超6S，间隔12S，99+99次，250W，中间看是否有沉淀，有则搅拌，之后超声，16000rpm，15min，4℃，用玻棒将细菌碎片拨掉，washing buffer共100mL+100μL DTT，1‰洗3次，每次超声：4S，10S，25次，250W，每次超声后16000rpm，15min，washing buffer洗涤，去除细菌碎片，称重，16000rpm，15min，resuspension buffer，60mL+60μL DTT，1‰悬浮，16000rpm，15min，按30mg/ml用dissolution buffer按1％加入DTT溶解，4℃搅拌溶解过夜，16000rpm，15min，倒出上清或分装成1ml/管，于‑20℃或‑80℃保存备用；(5)、荷包猪重链SLA‑2‑HB、轻链sβ2m及其口蹄疫病毒表位多肽的体外结合荷包猪重链SLA‑2‑HB、轻链β2m与口蹄疫病毒Hu62表位肽在体外结合：1)稀释法复性蛋白质①配制500mL refolding buffer，配方100mmol/L Tris,pH8.0，400mmol/L L‑Arg HCl，2mmol/L EDTA，5mmol/L GSH，0.5mmol/L GSSH，复性液预冷后加入0.5mmol/L PMSF，4℃缓慢搅拌至其完全溶解混匀，②用5mL或10mL注射器将溶解后的包涵体3‑5ml，分3次加，每次间隔8‑10小时，加入注射器内，使之一滴一滴的往refolding buffer内滴下，慢慢搅拌8‑10小时，在4℃条件下，先加轻链β2m，再加多肽，最后加荷包猪重链SLA‑2‑HB，荷包猪重链SLA‑2‑HB分三次加，荷包猪重链SLA‑2‑HB：轻链β2m：多肽(摩尔比)＝1:1:3，③复性后，用浓缩杯浓缩样品换液，缓冲液为分子筛buffer，再转到浓缩管内浓缩，如果复性体系小的话可直接用浓缩管浓缩换液，复性后如果复性液变得浑浊，4℃条件下离心去除沉淀后再浓缩；2)蛋白质浓缩将复性蛋白质体系转入到500mL的离心管内6000rpm，4℃离心15min，去沉淀，在4℃冷库将上清转入到350mL的搅拌式超滤装置中，浓缩杯底部事先装好蛋白截留膜10kDa，Millipore Centricon，利用N2进行加压浓缩，当浓缩至30mL时加入事先预冷抽滤好的分子筛buffer至体积150mL，分子筛buffer为20mmol/L Tris pH8.0，50mmol/L NaCl，继续浓缩重复上述步骤，最后浓缩至30mL，将溶液转移至30mL离心管中，16000rpm，4℃离心15min，将上清转到超滤浓缩管中进一步浓缩至4mL，将浓...
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：高凤山，
申请(专利权)人：大连大学，
类型：发明
国别省市：辽宁;21
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