一种油佐剂疫苗的快速定性定量检测方法技术

本发明专利技术提供了一种油佐剂疫苗的快速定性定量检测方法，其特征在于，包括以下步骤：将油佐剂疫苗破乳后，所得水相抗原样品进行ZIPTIP纯化，纯化后的样品进行定性定量检测；所述破乳的方法为：将油佐剂疫苗与正丁醇混合，然后加入竞争剂，振荡混匀后，离心，即得水相抗原样品。该方法通过加入竞争剂与表面活性剂竞争抗原结合位点，从而将油佐剂疫苗中的抗原释放至水相中大大提高了水相中的抗原回收率；再将破乳后的样品采用ZIPTIP进行纯化，使样品中的杂质有效去除，大大提高了样品的纯度，由此再将样品进行定性定量分析，提高了检测结果的准确性和可靠性。

Rapid qualitative and quantitative detection method of oil adjuvant vaccine

The present invention provides a rapid qualitative and quantitative detection method of oil adjuvant vaccine, characterized by comprising the following steps: oil adjuvant vaccine after demulsification, the water samples were purified ZIPTIP antigen, purified samples for qualitative and quantitative detection; the method is as follows: the demulsification of oil adjuvant vaccine and butanol mixed. Then join the competition agent, oscillation after mixing, centrifugation, namely aqueous antigen sample. The method by adding competition agent and surface active agent competition antigen binding site, which will be the oil adjuvant vaccine antigen release into water phase can greatly improve the recovery rate of antigen in aqueous phase; then after demulsification samples with ZIPTIP was purified to effectively remove impurities in the sample, greatly improving the purity of the samples. Then the qualitative and quantitative analysis of samples, improve the accuracy and reliability of test results.

【技术实现步骤摘要】
一种油佐剂疫苗的快速定性定量检测方法
本专利技术涉及口蹄疫疫苗检测
，具体涉及一种油佐剂疫苗的快速定性定量检测方法。
技术介绍
现有的疫苗质量标准中规定效力检验必须采用本动物进行检验，由于国家实行100％的强化免疫政策，很难选出易感的检验用动物，而且动物攻毒对实验设施要求高(BSL3级实验室)、耗时长(一个月以上)、资金花费大。如果采用血清中和试验选择易感动物，在技术上难以排除具有细胞免疫的非易感动物，在检验实际中经常发生检验数据不规律的问题，影响检验的准确性。因此口蹄疫疫苗尤其是用于牛的疫苗的质量检测一直困扰着兽药监测部门和相关生产企业。因此需要尽快研制体外检验技术，代替现有的本动物试验。当前国家对疫苗的检验正逐步过渡到对疫苗内抗原的检测，而当前较为普遍的方法为疫苗破乳后对抗原进行检测，通过将疫苗进行破乳处理，使抗原转移至水相中，继而对其进行后续的检测分析。众所周知，疫苗是由抗原与佐剂以一定比例、按特定程序乳化而成的，然而佐剂却为疫苗破乳检测带来了巨大障碍。由于疫苗乳化过程中所使用的油佐剂中成分复杂，含有表面活性剂，免疫增强剂等物质存在，破乳后的水相中往往会含有上述杂质和破乳剂，行业内并没有能够去除上述杂质和破乳剂的方法，而杂质及破乳剂等还会大大影响其后的检测过程，造成信号掩盖或干扰，压低了抗原信号的强度，甚至无法有效检测到其中的抗原，由于其中杂质的随机分配性，造成其检测方法的重复性不佳，同时增加了仪器维护成本。在疫苗行业内，如何对油佐剂疫苗进行破乳并对疫苗内成分进行检测和鉴定是业内公认的技术难点，由于油佐剂疫苗成分复杂，其中又含有大量的表面活性剂及免疫增强剂等物质，会对所有检测方法造成干扰，甚至无法检测，不能反映出疫苗内抗原的真实状态。虽然业内已有破乳方法，但其效率和效果均不佳，传统的破乳方法破乳后会有种种问题，例如破乳不完全、水相和油相分界不清晰、水相中检测不到抗原等问题一直困扰着业界。如何去寻找一种高效的破乳方法成了业内亟待解决的问题。ZIPTIP方法为一种简易的质谱前除盐的方法，在分析检测中用于盐类物质的去除。现有技术中尚未有将该方法用于抗原纯化的报道。
技术实现思路
针对现有技术中的缺陷，本专利技术提供了一种油佐剂疫苗的快速定性定量检测方法。本专利技术的目的是通过以下技术方案实现的：本专利技术提供了一种油佐剂疫苗的快速定性定量检测方法，包括以下步骤：将油佐剂疫苗破乳后，所得水相抗原样品进行ZIPTIP纯化，纯化后的样品进行定性定量检测；所述破乳的方法为：将油佐剂疫苗与正丁醇混合，然后加入竞争剂，振荡混匀后，离心，即得水相抗原样品。优选地，所述竞争剂包括氨基酸及其衍生物中的至少一种。优选地，所述竞争剂为赖氨酸、精氨酸、苯丙氨酸、组氨酸和脯氨酸中的一种。优选地，所述竞争剂的加入量为：每1ml油佐剂疫苗中加入1-40mg竞争剂，更优选1-20mg竞争剂。所述竞争剂的浓度过高，会导致竞争剂饱和析出，影响超滤过程；浓度过低，会导致竞争效果不佳，无法释放足够检测的抗原。优选地，所述油佐剂疫苗与正丁醇的体积比为9：1～5：5。更优选地，所述油佐剂疫苗与正丁醇的体积比为1:1。油佐剂疫苗与正丁醇的体积相同，可更好的保证疫苗完全破乳。优选地，所述ZIPTIP纯化的具体步骤如下：A1.使用50％ACN吸排活化ZIPTIP；A2.吸取样品吸排数次；A3.使用0.05％TFA水吸排清洗ZIPTIP；A4.使用含0.05％TFA的ACN洗脱样品，即可。优选地，所述纯化后的样品进行冻干或浓缩。优选地，采用电泳后染色的方法进行抗原样品的定量定性检测。采用本专利技术的破乳方法，由于抗原回收率高，得到的抗原样品无需进一步纯化，即可直接用于抗原的定量定性检测。现有技术相比，本专利技术具有如下的有益效果：1)本专利技术通过加入竞争剂与表面活性剂竞争抗原结合位点，从而将油佐剂疫苗中的抗原释放至水相中，与不加竞争剂相比，大大提高了水相中的抗原回收率。2)本方法采用ZIPTIP纯化方法，可有效去除抗原样品中的杂质，通过特异性吸附抗原，除去复杂样品中的表面活性剂等杂质，同时其洗脱后得到的样品可以直接用于高精度仪器的分析检测。附图说明通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本专利技术的其它特征、目的和优点将会变得更明显：图1为对比例1的方法破乳后水相中抗原浓度HPLC检测图谱。具体实施方式下面结合具体实施例对本专利技术进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本专利技术，但不以任何形式限制本专利技术。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本专利技术构思的前提下，还可以做出若干变形和改进。这些都属于本专利技术的保护范围。实施例1本实施例提供了一种油佐剂疫苗的快速定性定量检测方法，采用以下步骤：1)样品破乳将按照如下方法破乳处理：取10ml待检疫苗(市售的猪口蹄疫合成肽疫苗，浓度为75ug/ml)与正丁醇以体积比1:1混合，加入50mg组氨酸，震荡混匀，在4℃条件下，以3000r/min离心15分钟，离心后用10ml注射器小心抽取下层水相，即得水相抗原样品。2)样品的ZIPTIP纯化2.1将步骤1)制得的水相抗原样品冻干或浓缩，使用ZIPTIP进行纯化，其步骤如下：1.使用50％ACN吸排活化ZIPTIP；2.吸取样品吸排数次；3.使用0.05％TFA水吸排清洗ZIPTIP；4.使用含0.05％TFA的ACN洗脱样品。3)定性定量检测将通过步骤2)纯化后的样品体积为破乳后水相的1/10(即0.5ml)，即浓度提高10倍，进行电泳后染色，分析其条带，与其理论分子量进行对比，抗原条带出现在理论分子量大小区域，可对其初步定性，由条带灰度值可知其蛋白量约为10-15ug，上样量为10ul样品，其上样样品浓度为1-1.5mg/ml，折算其浓缩倍数(除以10)及破乳后体积变化(除以2)原始浓度为50-75ug/ml，与液相色谱测得浓度69.3ug/ml结果相符。本实施例采用的市售的猪口蹄疫合成肽疫苗与理论抗原浓度标准进行对照，对其HPLC检测图谱样品出峰位置进行积分，其积分信息如表1所示，样品中抗原含量以积分峰面积的形式体现，其积分峰面积为2738690。对本实施例采用Butanol+His破乳后水相中抗原样品浓度的HPLC检测图谱样品出峰位置进行积分，其积分信息如表2所示，样品中抗原含量以积分峰面积形式体现，其积分峰面积为2530549。对比表1和表2的结果可知，将两者积分信息对比后，其抗原回收率为92.4％，即破乳效率为92.4％。表1表2实施例2本实施例提供了一种油佐剂疫苗的快速定性定量检测方法，采用以下步骤：1)样品破乳将按照如下方法破乳处理：取10ml待检疫苗(市售的猪口蹄疫合成肽疫苗，浓度为75ug/ml)与正丁醇以体积比1:1混合，加入10mg苯丙氨酸，震荡混匀，在4℃条件下，以3000r/min离心15分钟，离心后用10ml注射器小心抽取下层水相，即得水相抗原样品。采用本实施例的方法对口蹄疫疫苗进行破乳，破乳效率为87.6％。2)样品的ZIPTIP纯化2.1将步骤1)制得的水相抗原样品冻干或浓缩，使用ZIPTIP进行纯化，其步骤如下：1.使用50％ACN吸排活化ZIPTIP；2.吸取样品吸排数次；3.使用0.05％TFA水吸排清洗Z本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种油佐剂疫苗的快速定性定量检测方法，其特征在于，包括以下步骤：将油佐剂疫苗破乳后，所得水相抗原样品进行ZIPTIP纯化，纯化后的样品进行定性定量检测；所述破乳的方法为：将油佐剂疫苗与正丁醇混合，然后加入竞争剂，振荡混匀后，离心，即得水相抗原样品。

【技术特征摘要】
1.一种油佐剂疫苗的快速定性定量检测方法，其特征在于，包括以下步骤：将油佐剂疫苗破乳后，所得水相抗原样品进行ZIPTIP纯化，纯化后的样品进行定性定量检测；所述破乳的方法为：将油佐剂疫苗与正丁醇混合，然后加入竞争剂，振荡混匀后，离心，即得水相抗原样品。2.根据权利要求1所述的油佐剂疫苗的快速定性定量检测方法，其特征在于，所述竞争剂包括氨基酸及其衍生物中的至少一种。3.根据权利要求2所述的油佐剂疫苗的快速定性定量检测方法，其特征在于，所述竞争剂为赖氨酸、精氨酸、苯丙氨酸、组氨酸和脯氨酸中的一种。4.根据权利要求1所述的油佐剂疫苗的快速定性定量检测方法，其特征在...

【专利技术属性】
技术研发人员：马贵军，俞爱敏，石海芳，刘健，
申请(专利权)人：申联生物医药上海股份有限公司，
类型：发明
国别省市：上海,31