短肽作为疫苗佐剂的应用及疫苗制造技术

本发明专利技术提供了一种短肽作为疫苗佐剂的应用及以上述短肽作为疫苗佐剂的疫苗，该短肽制备简单、简便地与抗原物理混合后即可有效增强抗原免疫应答的能力。所述短肽作为疫苗佐剂的应用中，所述短肽以基团X封端，所述短肽序列为X‑GFF，或所述短肽包含序列FFY。优选的，所述包含序列FFY的短肽序列为X‑FFY、X‑GFFY、X‑GFFYK、X‑GFFYE或X‑GFFYG；优选的，所述短肽为D构型。上述短肽可以作为免疫佐剂来增强抗原的免疫原性，使得主体发生强烈的抗原特异性的细胞免疫和体液免疫应答，且所述短肽能适用于各类抗原；所述短肽易于制备、成份单一可控。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种短肽作为疫苗佐剂的应用及疫苗。
技术介绍
随着免疫学的不断深入研究、日益成熟的基因工程技术以及合成技术的飞速发展，人类已研制出多种DNA重组疫苗、短肽疫苗等新型疫苗。这些新兴的疫苗虽然有很多优点，例如易于合成、提纯、抗原特异性强，但其较弱的免疫原性却成为其致命的缺点，导致其不能诱发强有力的免疫反应，限制了其在临床上的使用。在实际应用中，其往往需用免疫佐剂来增强其免疫原性或增强宿主对抗原的特异性应答。截止到目前为止，铝佐剂是唯一通过FDA批准的能用于人的佐剂，然而它只能激发相应的体液免疫，不能诱导机体产生相应的细胞免疫，而细胞免疫在很多疾病(病毒感染、肿瘤等)的免疫治疗方面又是必不可少的，因此铝佐剂对许多病毒、疾病等抗原无免疫佐剂性效果，这就使得开发新型的能够用于人体的治疗性免疫佐剂显得迫在眉睫。除了FDA批准的应用于人体的铝佐剂，现在研究中或者可以应用于动物的佐剂主要有弗氏佐剂、脂质体、单磷酰脂质A、细胞因子、CpG免疫调节序列等等。然而，这些免疫佐剂不是安全性差，就是造价太高、不易于合成纯化，或者增强抗原免疫应答的能力差，尚不能满足它们在临床使用的需求。
技术实现思路
专利技术目的本专利技术的一个目的是提供一种短肽作为疫苗佐剂的应用，该短肽制备简单、简便地与抗原物理混合后即可有效增强抗原免疫应答的能力。本专利技术的另一个目的是提供一种以上述短肽作为疫苗佐剂的疫苗。专利技术概述根据本专利技术的第一方面，本专利技术提供了一种短肽作为疫苗佐剂的应用，所
述短肽以基团X封端，所述短肽序列为X-GFF，或所述短肽包含序列FFY。所述基团X可选择本领域常用的含芳香环封端基团，例如Nap。“短肽”为本领域常用术语，指由3-9个氨基酸残基组成的短链肽。优选的，所述包含序列FFY的短肽序列为X-FFY、X-GFFY、X-GFFYK、X-GFFYE或X-GFFYG。优选的，所述短肽为D构型，例如所述短肽序列为X-GDFDF、X-DFDFDY、X-GDFDFDY、X-GDFDFDYDK、X-GDFDFDYDE或X-GDFDFDYDG。优选的，X为Nap、PTZ、Bio或Fmoc，更优选为Nap。进一步优选的，所述短肽序列为Nap-DFDFDY、Nap-GDFDFDY、Nap-GDFDFDYDK或Nap-GDFDFDYDG；最优选的，所述短肽序列为Nap-GDFDFDYDK。以下为上述部分优选的短肽的结构式：本专利技术中所述氨基酸序列如未特别说明，则对其构型无限制。所述短肽可采用公知的FMOC-固相合成方法合成。所述短肽作为疫苗佐剂应用时可选用多种物理形式，对其增强免疫应答的能力不会产生实质性影响，例如可以与水混合均匀后与抗原混合得到疫苗，或者，由于所述短肽具有良好的成胶性能，也可以以短肽水凝胶的形式进行应用，具体的，所述短肽的水混合物经加热冷却的方法形成短肽水凝胶，然后与抗原混合，静置后形成的水凝胶用作疫苗。作为本领域常识，所述短肽的水混合物应具备良好的生物相容性，因此，需要将短肽与具有良好生物相容性的水溶液混合得到所述短肽的水混合物。常见的，所述具有良好生物相容性的水溶液可以是生理盐水或PBS溶液。这种疫苗制备方法简单实用、成分可控。所述形成水凝胶的加热冷却方法为公知方法，具体为：使用电吹风或者油浴锅等加热装置加热短肽的水混合物至短肽完全溶解(一般需要加热到到90℃以上)，冷却之后形成凝胶(一般冷却至20-40℃即可)。成胶与否通过倒置瓶子的方法判断，保留在瓶子底部为水凝胶，如果是流动的则为液体。所述疫苗可以为蛋白疫苗、细胞疫苗或短肽疫苗。所述短肽的用量可以由本领域技术人员经简单实验确定，一般用于蛋白疫苗和短肽疫苗时，所述短肽与抗原的质量比为5:1-30:1，更优选为5:1-20:1，用
于细胞疫苗时，所述短肽的最终浓度为0.5-5mg/mL。在本专利技术的第二方面，还提供了一种以上述短肽作为疫苗佐剂的疫苗。所述短肽可以方便地与抗原物理混合得到疫苗。专利技术人发现，上述短肽可以作为免疫佐剂来增强抗原的免疫原性，使得主体发生强烈的抗原特异性的细胞免疫和体液免疫应答，且所述短肽能适用于各类抗原；所述短肽易于制备、成份单一可控。本专利技术增加了免疫佐剂的种类，为开发能应用于人体的免疫佐剂提供了有价值的信息。附图说明图1：蛋白疫苗vac-1、vac-2、OVA、Alum-OVA引发免疫反应的抗体滴度；图2：蛋白疫苗vac-2、vac-3、vac-4、vac-5、OVA、Alum-OVA引发免疫反应的抗体滴度；图3：蛋白疫苗vac-2、vac-6、vac-7、vac-8、vac-9、OVA、Alum-OVA引发免疫反应的抗体滴度；图4：蛋白疫苗vac-2、vac-10、vac-11、vac-12、OVA引发免疫反应的抗体滴度；图5：细胞疫苗vac-13、vac-14、XTC、L-gel、D-gel刺激CD8+IFN-γ+T细胞增殖的效果(图5a))以及它们的肿瘤抑制效果(图5b))；图6：短肽疫苗vac-15、epitope、Alum-epitope引发免疫反应的抗体滴度。具体实施方式下面用实施例进一步描述本专利技术，但所述实施例仅用于本专利技术而不是限制本专利技术。以下实施例中，通过本领域常用的倒置小瓶的方法检验水凝胶的形成与否。以下实施例中所涉及制剂来源如下：培养基，RMPI 1640，购自赛默飞世尔科技(ThermoFisher Scientific)，无菌；胎牛血清，购自赛默飞世尔科技(ThermoFisher Scientific)，无菌；2-cl-Trt树脂购自天津南开和成科技有限公司，活性1.2mmol/mL；N,N-二异丙基乙胺(以下用DIEPA表示)，购自西格马奥德里奇公司(Sigma-Aldrich)，纯度99％；苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯(以下用HBTU表示)，购自吉尔生化(上海)有限公司，纯度98％；三氟乙酸(以下用TFA表示)，购自西格马奥德里奇公司(Sigma-Aldrich)，纯度99％；三异丙基硅烷(以下用TIS表示)，购自西格马奥德里奇公司(Sigma-Aldrich)，纯度99％；L构型及D构型氨基酸购自吉尔生化(上海)有限公司，纯度98％；无内毒素的鸡卵清蛋白(以下简称OVA蛋白)购自InvivoGen公司，纯度99％；铝佐剂购自赛默飞世尔科技(ThermoFisher Scientific)，纯度99％；萘乙酸、氟代吩噻嗪、生物素购自西格马奥德里奇公司(Sigma-Aldrich，纯度99％；短肽B+T epitope购自吉尔生化(上海)有限公司，纯度98％；癌细胞EG7购自上海歌凡生物，并按以下步骤培养：1)把水浴锅提前升温至37℃，将培养基(RPMI 1640)、胎牛血清等放入水浴锅预热，并且同时打开超净台紫外灯照射半小时；2)从液氮罐中取出冻存的癌细胞EG7，迅速放置在37℃的水浴锅中使细胞解冻，之后迅速转移到超净台里进行如下操作：把含细胞的溶液用移液器小心地转移到含有培养基的离心管中，离心5分钟，去上清，用含有10％胎牛血清的培养基重悬，转移到含有10％胎牛血清的培养基的培养皿中，然后放入37℃培养箱中培养；3)第二天观察细胞状态，待细胞状态良好后，传一代以后本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种短肽作为疫苗佐剂的应用，其特征在于，所述短肽以基团X封端，所述短肽序列为X‑GFF，或所述短肽包含序列FFY。

【技术特征摘要】
1.一种短肽作为疫苗佐剂的应用，其特征在于，所述短肽以基团X封端，所述短肽序列为X-GFF，或所述短肽包含序列FFY。2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述短肽序列为X-FFY、X-GFFY、X-GFFYK、X-GFFYE或X-GFFYG。3.如权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述短肽为D构型。4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述短肽序列为X-GDFDF、X-DFDFDY、X-GDFDFDY、X-GDFDFDYDK、X-GDFDFDYDE或X-GDFDFDYDG。5.如权利要求1-4中任一项所述的应用，其特征在于，X为Nap、PTZ、Bio或Fmoc，优选为Nap。6.如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述短肽序列为Nap-DFDFDY、...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨志谋，王玲，杨成彪，王怀民，
申请(专利权)人：南开大学，
类型：发明
国别省市：天津;12