用热荧光技术检测口蹄疫病毒疫苗热稳定性的方法及其应用技术

本发明专利技术公开了一种用热荧光技术对口蹄疫病毒疫苗进行热稳定性检测的方法，是使用核酸染料一种荧光染料，或核酸染料和蛋白染料两种荧光染料，与口蹄疫病毒疫苗结合，放入定量PCR仪中梯度升温，通过熔解曲线获得口蹄疫病毒疫苗的核酸释放温度Tr或蛋白去折叠温度Tm，以较低温度值确定为口蹄疫病毒疫苗的热稳定温度。本发明专利技术方法通用性好、灵敏度高、试验速度快、标准误差小、操作简单，能准确评估病毒衣壳的热稳定性，用于口蹄疫病毒疫苗热稳定性的检测，在口蹄疫病毒疫苗的制备、储存和运输中发挥作用。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物检测
，特别是涉及一种用热荧光技术对口蹄疫病毒疫苗进行热稳定性检测的方法及其在口蹄疫病毒疫苗的制备、储存和运输中的应用。
技术介绍
口蹄疫口蹄疫是由口蹄疫病毒(Foot-and-MouthDiseaseVirus，FMDV)感染引起的偶蹄动物共患的急性、热性、接触性传染病，最易感染的动物是黄牛、水牛、猪、骆驼、羊、鹿等，黄羊、麝、野猪、野牛等野生动物也易感染此病。该病以牛最易感，羊的感染率低。口蹄疫在亚洲、非洲和中东以及南美均有流行，在非流行区也有散发病例。口蹄疫发病后一般不致死，但会使病兽的口、蹄部出现大量水疱，高烧不退，使实际畜产量锐减。另外，有个别口蹄疫病毒的变种可传染给人。因此，每次爆发后只能屠宰和集体焚毁染病牲畜以绝后患。由于口蹄疫传播迅速、难于防治、补救措施少，被称为畜牧业的\头号杀手\。口蹄疫病毒口蹄疫病毒(FootandMouthDiseaseVirus，FMDV)是偶蹄类动物高度传染性疾病(口蹄疫)的病原，属于小RNA病毒科口蹄疫病毒属，有七个血清型：O型、A型、亚洲Ⅰ型、C型以及南非1、2、3型。各血清型之间没有交叉保护。现阶段我国主要流行O型、A型和亚洲Ⅰ型。在口蹄疫病毒的中心为一条单链的正链RNA，由大约8000个碱基组成，是感染和遗传的基础；周围包裹着蛋白质决定了病毒的抗原性、免疫性和血清学反应能力；病毒外壳为对称的20面体。口蹄疫病毒的免疫是依赖T细胞的B细胞应答，疫苗接种主要诱导中和抗体的产生。预防口蹄疫接种口蹄疫疫苗是预防口蹄疫病的有效手段。口蹄疫疫苗的种类口蹄疫疫苗包括传统疫苗和新型疫苗。传统口蹄疫疫苗包括活疫苗(或弱毒疫苗)和灭活疫苗，新型口蹄疫疫苗包括亚单位疫苗、载体疫苗、核酸疫苗、基因缺失疫苗、合成肽疫苗、可饲疫苗和多表位疫苗等。(1)活疫苗(或弱毒疫苗)活疫苗是指经充分致弱，尚能在动物体内增殖，接种后能够引起动物发生无症状的感染，从而使机体产生免疫反应的生物制剂，又称为弱毒疫苗。(2)灭活疫苗灭活疫苗是指用物理或化学方法使口蹄疫病毒丧失感染力而保留抗原性，再添加佐剂后制成的疫苗制剂。口蹄疫病毒的实验室检验技术概况目前，口蹄疫病毒的检测技术主要有生物学试验(包括动物试验和细胞培养)、血清学诊断技术(包括补体结合试验、中和试验、凝集试验、免疫扩散、沉淀反应、免疫电泳技术、放射免疫试验和免疫电镜技术和免疫胶体金快速检测技术等)和分子生物学检测技术(包括核酸杂交、等电点聚焦电泳、聚合酶链式反应及核酸序列分析等)。从动物试验到血清学试验以至分子生物学诊断技术，特异性越来越高，灵敏度也越来越高，但是这些检测技术都不能对口蹄疫病毒的热稳定性进行检测。口蹄疫病毒疫苗生产过程中所用检验方法现况口蹄疫病毒的热稳定性对于疫苗的研发、储存以及运输至关重要。这个问题在发展中国家尤为显著，因为发展中国家的疫苗运输需要更长的时间，而且也没有一个既定的冷链疫苗接种程序的规划。现如今，用于检测口蹄疫病毒的热稳定性的方法是用样品对标准品的侵染力来确定每单位体积内口蹄疫病毒的数量(WHO，2006.ExpertCommitteeonBiologicalStandardization:GuidelinesonStabilityEvaluationofVaccines.Adopted2006.)。口蹄疫病毒粒子(146S)完整的口蹄疫病毒粒子(146S)是口蹄疫病毒疫苗的有效成分，146S抗原的含量直接决定了口蹄疫病毒疫苗的质量，146S抗原的检测既可以指导疫苗的生产，又能评价疫苗的质量。146S病毒粒子是口蹄疫的主要免疫原，生产过程中这种病毒粒子任何形式的降解都会导致疫苗免疫效力的下降。相关技术热扫描是一种鉴定蛋白质热稳定性的行之有效的方法，此方法是通过慢慢加热蛋白样品并监测其状态。运用傅里叶变换红外光谱(FTIR)和圆二色谱(CD)法监测，当温度升高时，蛋白质的二级结构都会改变或遭到破坏。然而，运用热量和光强散射法进行监测在现在来说更受欢迎。热荧光(Thermofluor)也称为差示扫描荧光法(DSF)或热转移试验，现已用来测定改变蛋白质热稳定性的条件，或者用来寻找更稳定的同系物或突变体。热荧光检测方法最早出现在2001年。这种方法是用一种能令荧光基团与蛋白质的疏水结构相结合的荧光染料(最常用的是SYPROOrange)来培养蛋白质。在培养的蛋白质样品加热后，随着温度的升高，荧光会被检测出来。展开(去折叠)的蛋白和暴露出的疏水结构，以温度和荧光升降的比例函数呈现出来。这种检测方法可进行小剂量检测，并且能够在任何定量PCR仪上使用(M.W.Pantoliano,E.C.Petrella,etc.2001.High-densityminiaturizedthermalshiftassaysasageneralstrategyfordrugdiscovery.J.Biomol.Screen.,6(2001),pp.429–440)。虽如此，但在面对病毒疫苗热稳定性检测时，针对病毒热稳定性的具体情况还存在诸如机理和应用条件(如荧光染料的选择)等需要攻克的问题。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种用热荧光技术对口蹄疫病毒疫苗进行热稳定性检测的方法。本专利技术所提供的用热荧光技术对口蹄疫病毒疫苗进行热稳定性检测的方法，是使用核酸染料一种荧光染料，或核酸染料和蛋白染料两种荧光染料，与口蹄疫病毒疫苗结合，放入定量PCR仪中梯度升温，通过熔解曲线获得口蹄疫病毒疫苗的核酸释放温度Tr或蛋白去折叠温度Tm，以较低温度值确定为口蹄疫病毒疫苗的热稳定温度。所述核酸染料用于检测核酸释放温度Tr，所述核酸染料单独使用或与蛋白染料组合使用。所述核酸染料为SYBRGreenII或SYTO9，反应液浓度为100×。所述蛋白染料用于检测蛋白去折叠温度Tm。所述蛋白染料为SYPROOrange或SYPROred，反应液浓度为50×。所述熔解曲线包括原始荧光信号的曲线(横坐标为温度，纵坐标为荧光量RFU)和对应原始荧光曲线的负导数曲线(横坐标为温度，纵坐标为对应原始荧光的负导数值)，负导数曲线的波谷对应温度判定为核酸释放温度Tr或蛋白去折叠温度Tm。所述结合是将蛋白染料或核酸染料分别与口蹄疫病毒疫苗混合分别获得核酸释放曲线或蛋白去折叠曲线，或将蛋白染料和核酸染料同时与口蹄疫病毒疫苗混合利用定量PCR仪中不同的荧光通道分别获得核本文档来自技高网...

【技术保护点】
用热荧光技术对口蹄疫病毒疫苗进行热稳定性检测的方法，是使用核酸染料一种荧光染料，或核酸染料和蛋白染料两种荧光染料，与口蹄疫病毒疫苗结合，放入定量PCR仪中梯度升温，通过熔解曲线获得口蹄疫病毒疫苗的核酸释放温度Tr或蛋白去折叠温度Tm，以较低温度值确定为口蹄疫病毒疫苗的热稳定温度。

【技术特征摘要】
1.用热荧光技术对口蹄疫病毒疫苗进行热稳定性检测的方法，是使用核酸染料
一种荧光染料，或核酸染料和蛋白染料两种荧光染料，与口蹄疫病毒疫苗结合，放入
定量PCR仪中梯度升温，通过熔解曲线获得口蹄疫病毒疫苗的核酸释放温度Tr或蛋
白去折叠温度Tm，以较低温度值确定为口蹄疫病毒疫苗的热稳定温度。
2.根据权利要求1所述的用热荧光技术对口蹄疫病毒疫苗进行热稳定性检测的
方法，其特征在于：所述核酸染料用于检测核酸释放温度Tr，所述核酸染料单独使用
或与蛋白染料组合使用。
3.根据权利要求1或2所述的用热荧光技术对口蹄疫病毒疫苗进行热稳定性检
测的方法，其特征在于：所述核酸染料为SYBRGreenII或SYTO9，反应液浓度为100
×。
4.根据权利要求1或2或3所述的用热荧光技术对口蹄疫病毒疫苗进行热稳定
性检测的方法，其特征在于：所述蛋白染料用于检测蛋白去折叠温度Tm。
5.根据权利要求4所述的用热荧光技术对口蹄疫病毒疫苗进行热稳定性检测的
方法，其特征在于：所述蛋白染料为SYPROOrange或SYPROred，反应液浓度为50
×。
6.根据权利要求1或2或3所述的用热荧光技术对口蹄疫病毒疫苗进行热稳定
性检测的方法，其特征在于：所述熔解曲线包括原始荧光信号的曲线(横坐标为温度，
纵坐标为荧光量RFU)和对应原始荧光曲线的负导数曲线(横坐标为温度，纵坐标为
对应原始荧光的负导数值)，负导数曲线的波谷对应温度判定为核酸释放温度Tr或
蛋白去折叠温度Tm。
7.根据权利要求1至6任一所述的用热荧光技术对口蹄疫病毒疫苗进行热稳定
性检测的方法，其特征在于：所述结合是将蛋白染料或核酸染料分别与口蹄疫病毒疫
苗混合分别获得核酸释放曲线或蛋白去折叠曲线，或将蛋白染料和核酸染料同时与口
蹄疫病毒疫苗混合利用定量PCR仪中不同的荧光通道分别获得核酸释放曲线或蛋白去
折叠曲线。
8.根据权利要求1至7任一所述的用热荧光技术对口蹄疫病毒疫苗进行热稳定
性检测的方法，其特征在于：所述口蹄疫病毒疫苗为Re-A株、Asia-1/JS株或O/MYA98
株。
9.根据权利要求1-8任一所述的用热荧光技术对口蹄疫病毒疫苗进行热稳定性
检测的方法，其特征在于：具体包括以下步骤：
1)准备口蹄疫病毒疫苗样品：以口蹄疫病毒疫苗中口蹄疫病毒粒子(146S)浓
度足以判断其中有完整病毒粒子的疫苗株为样品；
2)将蛋白染液与核酸染液稀释至可用浓度：蛋白染料为SYPROOra...

【专利技术属性】
技术研发人员：王云凌，张贵刚，刘艳霞，魏学峰，刘国英，范秀丽，韩志玲，王艳杰，王秀明，张宸，
申请(专利权)人：金宇保灵生物药品有限公司，
类型：发明
国别省市：内蒙古;15