牛A型口蹄疫国外流行毒株广谱多表位重组疫苗及其制备方法和应用技术

本发明专利技术公开了一种牛A型口蹄疫国外流行毒株广谱多表位重组疫苗及其制备方法和应用，属于兽用疫苗研究领域。本发明专利技术采用“抗原化抗体”策略以及全新的反向疫苗操作学技术和策略，将与我国接壤国家最近流行的牛A型口蹄疫病毒的代表性毒株的优势抗原表位进行合理的串联后，与牛IgG重链恒定区偶联，克隆入原核表达载体构建重组表达载体，转化大肠杆菌感受态细胞表达重组抗原并采用Ni-NAT层析柱纯化后，经Bio-Rad蛋白定量试剂盒定量后单独或与重组口蹄疫病毒3D蛋白配伍后制备疫苗，动物免疫试验结果显示，该重组蛋白或配伍后的疫苗均能够刺激机体产生高效价的保护性抗体，同时保护免疫动物抵抗同源病毒的攻击，具有良好的应用前景。

【技术实现步骤摘要】
牛A型口蹄疫国外流行毒株广谱多表位重组疫苗及其制备方法和应用
本专利技术涉及一种牛A型口蹄疫疫苗及其制备方法和应用，尤其涉及一种牛A型口蹄疫国外流行毒株广谱多表位重组疫苗及其制备方法和应用，属于兽用疫苗研究领域。
技术介绍
口蹄疫作为主要经济畜种猪、牛和羊的重大动物疫病不仅严重威胁畜牧业的健康发展，而且涉及动物源性食品安全以及其外贸出口。一旦发生疫情损失惨重，政治影响恶劣。灭活疫苗在防控FMD中发挥十分重要的作用，但由于生产此类疫苗存在生物安全隐患，需要区分疫苗免疫和自然感染动物（DIVA）。为此，1991年后欧盟成员国禁止使用灭活疫苗进行疫情防控，美国也禁止在其本国生产和使用灭活疫苗。我国拥有漫长的国际边界线，与中亚，南亚，东亚等口蹄疫多发地区的国家接壤，这些地区经常发生不同血清型口蹄疫流行，给我国口蹄疫防控造成了巨大的压力，曾发生多起口蹄疫病毒传入我国引起疫情的事例。因此，为了防止国外毒株通过边境交叉放牧，活畜及其产品走私造成外源性病毒的引入，除了加大疫情监控外，研制能防控外来流行毒株的新型疫苗显得尤为重要，为我国防控口蹄疫外来毒株传入提供优质安全高效的新型疫苗储备。采用分子生物学，蛋白组学及反向疫苗学等相关技术研发安全高效的新型FMD疫苗已经成为热点课题。迄今，已经通过分子生物学技术研制的口蹄疫新型疫苗并申报国家专利的有猪O型口蹄疫重组疫苗申获了专利（上海复旦大学郑赵鑫教授研制），并获得农业部颁布的“一类新兽药证书‖，遗憾的是该产品至今没有商品化。本实验室研制的牛和羊口蹄疫Asia1型多表位疫苗经动物免疫效力试验证实具有良好的免疫原性，且已申获专利，专利技术名称分别为“牛口蹄疫病毒Asia1型重组多表位疫苗及其制备方法”（专利号：ZL200910259363.6）和”羊口蹄疫病毒Asia1型多表位疫苗及其制备方法”（专利号：ZL200910224025.9）。如今，利用反向疫苗学技术研制新型疫苗已经成为未来疫苗发展的趋势。传统灭活疫苗生物安全的不确定性加速了研究口蹄疫新型疫苗的进程。值得一提的是，近年来通过增加T细胞表位和自身蛋白分子作为载体蛋白明显改善了重组抗原的免疫原性，增强了免疫效果。同时解决了多表位广谱抗原基因的多次串联后表达效率低下的技术瓶颈，不仅能获得大量高纯度靶标蛋白，而且也能保证所表达靶标蛋白的免疫原性，这为研制口蹄疫广谱多表位疫苗，防止由于抗原谱单一导致免疫失败提供了很好的技术支持和理论依据。本研究采用分子生物学技术以及先进的设计理念，设计涵盖并合成了与我国接壤国家最近分离的牛口蹄疫病毒A型代表毒株的优势抗原表位序列，研制针对外来流行毒株的广谱多表位疫苗，这对于防止国外口蹄疫毒株传入我国具有重要的意义，为我国防控外来毒株疫情提供疫苗战略储备。
技术实现思路
本专利技术的目的之一在于提供一种牛A型口蹄疫国外流行毒株广谱多表位重组抗原，该抗原涵盖了与我国接壤国家最近流行的牛A型口蹄疫病毒的代表性毒株的优势抗原表位；本专利技术的目的之二在于提供所述重组抗原在制备牛A型口蹄疫疫苗中的应用；本专利技术的目的之三在于提供一种牛A型口蹄疫国外流行毒株广谱多表位疫苗，其含有本专利技术所述的重组抗原。为了达到所述目的，本专利技术采用了以下技术方案：本专利技术的一种牛A型口蹄疫国外流行毒株广谱多表位重组抗原，其特征在于所述的重组抗原是将与我国接壤国家最近流行的牛A型口蹄疫病毒的代表性毒株的优势抗原表位进行串联后，与牛IgG重链恒定区偶联后构建得到，所述的重组抗原含有以下（a）或（b）所示的氨基酸序列：（a）SEQIDNO：6所示的氨基酸序列；或（b）将SEQIDNO：6所示的氨基酸序列通过一个或多个氨基酸残基的替换、缺失或插入而获得的仍具有抗原表位功能的蛋白衍生物。在本专利技术的一个具体实施例中，所述的重组抗原的氨基酸序列如SEQIDNO：6所示。编码所述的重组抗原的核苷酸序列，其特征在于具有以下（a）、（b）或（c）所示的核苷酸序列：（a）SEQIDNO：5所示的核苷酸序列；或（b）编码SEQIDNO：6所示的氨基酸序列的核苷酸序列；或（c）编码具有抗原表位功能的蛋白衍生物的核苷酸序列，该蛋白衍生物通过将SEQIDNO：6所示的氨基酸序列的一个或多个氨基酸残基替换、缺失或插入而获得。在本专利技术的一个具体实施例中，所述的核苷酸序列如SEQIDNO：5所示。含有本专利技术所述的核苷酸序列的重组表达载体以及含有该载体的宿主细胞也在本专利技术所保护的范围之内。进一步的，本专利技术还提出了本专利技术所述的多表位重组抗原在制备预防牛A型口蹄疫疫苗中的应用。及所述的核苷酸序列在制备预防牛A型口蹄疫疫苗中的应用。一种牛A型口蹄疫国外流行毒株广谱多表位疫苗，其特征在于含有本专利技术所述的多表位重组抗原。优选的，所述的多表位疫苗还含有口蹄疫病毒3D蛋白的全长氨基酸序列，所述的口蹄疫病毒3D蛋白的全长氨基酸序列如SEQIDNO：8所示。本研究采用“抗原化抗体”策略以及全新的反向疫苗学技术和策略，将与我国接壤国家最近流行的牛A型口蹄疫病毒的代表性毒株的优势抗原表位进行合理的串联后，与牛IgG免疫刺激片断（IgG重链恒定区）偶联，克隆入原核表达载体如pET-30a（+）构建重组表达载体，转化大肠杆菌感受态细胞（例如BL21,BL21(DE3)，BL21(DE3)pLys系列等）表达重组抗原并采用Ni-NAT层析柱纯化后，经Bio-Rad蛋白定量试剂盒定量后单独或与重组口蹄疫病毒3D蛋白配伍后制备疫苗，动物免疫试验结果显示，该重组蛋白或疫苗配伍均能够刺激机体产生高效价的保护性抗体，同时保护免疫动物抵抗同源病毒的攻击，因而本专利技术具有良好的应用前景。附图说明图1为重组表位抗原单独或与3D蛋白联合免疫豚鼠效力试验结果；结果显示，在加强免疫后，抗原单独或与3D蛋白联合免疫豚鼠均能诱导机体产生高水平的中和抗体，第二次加强免疫后血清抗体效价进一步升高，显示出该抗原具有良好的免疫原性；图2为重组抗原免疫牛实验结果；结果显示，重组抗原能够诱导宿主动物产生口蹄疫特异性中和抗体，加强免疫后，保护性抗体水平进一步升高。具体实施方式下面结合具体实施例来进一步描述本专利技术，本专利技术的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本专利技术的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本专利技术的精神和范围下可以对本专利技术技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本专利技术的保护范围内。实施例1牛A型口蹄疫国外流行毒株广谱多表位重组抗原的制备1、A型口蹄疫病毒VP1基因的生物信息学分析：口蹄疫病毒结构蛋白VP1是病毒的优势抗原，无论是分离纯化的天然VP1蛋白还是重组表达产物都能诱导机体产生保护性中和抗体，具有型特异性。A型口蹄疫病毒VP1基因全长有639个核苷酸，编码一条213个氨基酸组成的蛋白，其主要抗原表位集中在140–160位氨基酸和200–213位氨基酸区段。本研究用DNAStar生物软件对与我国接壤一些国家最近分离的牛A型口蹄疫病毒代表毒株(NCBI登录号：FJ755067，HQ666886和AY59371)进行序列分析，确定了优势抗原表位为135–160位氨基酸，并确定以200–213位氨基酸为另外一个B抗原表位，同时添加了VP1区21–28位的保守氨基酸序本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种牛A型口蹄疫国外流行毒株广谱多表位重组抗原，其特征在于所述的重组抗原是将与我国接壤国家最近流行的牛A型口蹄疫病毒的代表性毒株的优势抗原表位进行合理串联后，与牛IgG重链恒定区偶联后构建得到，所述的重组抗原含有以下（a）或（b）所示的氨基酸序列：（a）SEQ ID NO：6所示的氨基酸序列；或（b）将SEQ ID NO：6所示的氨基酸序列通过一个或多个氨基酸残基的替换、缺失或插入而获得的仍具有抗原表位功能的蛋白衍生物。

【技术特征摘要】
1.一种牛A型口蹄疫毒株广谱多表位重组抗原，其特征在于所述的重组抗原的氨基酸序列如SEQIDNO：6所示。2.编码权利要求1所述的重组抗原的核苷酸序列。3.如权利要求2所示的核苷酸序列，其特征在于所述的核苷酸序列如SEQIDNO：5所示。4.一种重组表达载体，其特征在于含有权利要求2或3所述的核苷酸序列。5.一种宿主细胞，其特征在于含有权利要求4所述的重组表达载体。6.权利要...

【专利技术属性】
技术研发人员：邵军军，常惠芸，陈建文，
申请(专利权)人：中国农业科学院兰州兽医研究所，
类型：发明
国别省市：甘肃;62