牛A型口蹄疫多表位疫苗及其制备方法和应用技术

本发明专利技术公开了一种牛A型口蹄疫多表位重组疫苗及其制备方法和应用，属于兽用疫苗研究领域。本发明专利技术采用“抗原化抗体”策略以及全新的反向疫苗学技术和策略，将曾经在我国流行的牛A型口蹄疫病毒代表性毒株的优势抗原表位进行合理的串联后，与牛IgG免疫刺激片断（IgG重链恒定区）偶联，克隆入原核表达载体构建重组表达载体，转化大肠杆菌感受态细胞表达重组抗原并采用Ni-NAT层析柱纯化后，经Bio-Rad蛋白定量试剂盒定量后单独或与重组口蹄疫病毒3D蛋白配伍制备疫苗，动物免疫试验结果显示，该重组蛋白或配伍后的疫苗均能够刺激机体产生高效价的保护性抗体，同时能够保护免疫动物抵抗病毒的攻击，因而本发明专利技术具有良好的应用前景。

【技术实现步骤摘要】
【专利摘要】本专利技术公开了一种牛A型口蹄疫多表位重组疫苗及其制备方法和应用，属于兽用疫苗研究领域。本专利技术采用“抗原化抗体”策略以及全新的反向疫苗学技术和策略，将曾经在我国流行的牛A型口蹄疫病毒代表性毒株的优势抗原表位进行合理的串联后，与牛IgG免疫刺激片断（IgG重链恒定区）偶联，克隆入原核表达载体构建重组表达载体，转化大肠杆菌感受态细胞表达重组抗原并采用Ni-NAT层析柱纯化后，经Bio-Rad蛋白定量试剂盒定量后单独或与重组口蹄疫病毒3D蛋白配伍制备疫苗，动物免疫试验结果显示，该重组蛋白或配伍后的疫苗均能够刺激机体产生高效价的保护性抗体，同时能够保护免疫动物抵抗病毒的攻击，因而本专利技术具有良好的应用前景。【专利说明】牛A型口蹄疫多表位疫苗及其制备方法和应用
本专利技术涉及一种牛A型口蹄疫疫苗及其制备方法和应用，本专利技术尤其涉及一种牛 A型口蹄疫多表位重组疫苗及其制备方法和应用，属于兽用疫苗研究领域。
技术介绍
口蹄疫作为主要经济畜种猪、牛和羊的重大动物疫病不仅严重威胁畜牧业的健康 发展，而且涉及动物源性食品安全以及其外贸出口。一旦发生疫情损失惨重，政治影响恶 劣。灭活疫苗在防控FMD疫情中发挥着十分重要的作用，但由于生产此类疫苗需要建设防 止病原体逃逸的高级别生物安全生产车间，区分疫苗免疫和自然感染动物（DIVA)。更为严 重的是病毒灭活不完全有引起疫苗毒株流行的危险。为此，1991年后欧盟成员国停止使用 灭活疫苗，美国也禁止在其本国生产和使用灭活疫苗。 采用分子生物学，蛋白组学以及反向疫苗学等相关技术研发安全高效的FMD新 型疫苗已经成为疫苗研制的热点课题。目前，已经有我国上海复旦大学郑赵鑫教授研制 的猪0型口蹄疫病毒重组疫苗申获了专利，并获得农业部颁布的一一类新兽药证书||， 但该产品至今没有实现商品化。我们实验室通过新技术研制的牛和羊Asial型口蹄疫 重组多表位疫苗经动物免疫效力试验证实具有良好的免疫原性，并申获了相关技术的专 利，其专利技术名称分别为"牛口蹄疫病毒Asial型重组多表位疫苗及其制备方法"（专利 号：ZL200910259363. 6)和"羊口蹄疫病毒Asial型多表位疫苗及其制备方法"（专利号： ZL200910224025. 9)〇 如今，利用反向疫苗学技术研制新型疫苗已经成为未来疫苗发展的趋势。传统灭 活疫苗生物安全的不确定性加速了研究口蹄疫新型疫苗的进程。值得一提是，近年来通过 增加 T细胞表位，并辅以宿主自身免疫分子为载体蛋白以加强抗原递呈能力、增加分子量、 促进B细胞成熟分化等手段和策略明显改善了疫苗的免疫原性。同时解决了多表位广谱抗 原基因的多次串联后表达效率低下等技术瓶颈，不仅能获得大量高纯度靶标蛋白，而且也 能保证所表达靶标蛋白的免疫原性，这为研制口蹄疫广谱多表位疫苗，防止由于抗原谱单 一导致免疫失败提供了很好的技术支持和理论依据。 本专利技术采用分子生物学技术以及先进的设计理念，针对我国牛A型口蹄疫病毒毒 株的主要抗原表位序列,研制牛A型口蹄疫广谱多表位疫苗，以期从根本上解决目前表位 疫苗免疫效力低下和抗原谱单一的缺陷，该研究成果对控制和净化我国牛A型口蹄疫具有 重要的意义。
技术实现思路
本专利技术的目的之一在于提供一种牛A型口蹄疫多表位重组抗原，该抗原涵盖了曾 经在我国流行的牛A型口蹄疫病毒的代表性毒株的优势抗原表位序列； 本专利技术的目的之二在于提供所述重组抗原在制备牛A型口蹄疫疫苗中的应用； 本专利技术的目的之三在于提供一种牛A型口蹄疫多表位疫苗，其含有本专利技术所述的 重组抗原。 为了达到所述目的，本专利技术采用了以下技术方案： 本专利技术的一种牛A型口蹄疫多表位重组抗原，其特征在于所述的重组抗原是将曾 经在我国流行的牛A型口蹄疫病毒的代表性毒株的优势抗原表位进行串联后，与牛IgG重 链恒定区偶联后构建得到，所述的重组抗原含有以下（a)或（b)所示的氨基酸序列： (a) SEQ ID N0 :6所示的氨基酸序列；或 (b)将SEQ ID N0 :6所示的氨基酸序列通过一个或多个氨基酸残基的替换、缺失 或插入而获得的仍具有抗原表位功能的蛋白衍生物。 在本专利技术的一个具体实施例中，所述的重组抗原的氨基酸序列如SEQ ID N0 :6所 /_J、1 〇 编码所述的重组抗原的核苷酸序列，其特征在于具有以下（a)、（b)或（c)所示的 核苷酸序列： (a) SEQ ID N0 :5所示的核苷酸序列；或 (b)编码SEQ ID N0 :6所示的氨基酸序列的核苷酸序列；或 (c)编码具有多表位抗原功能的蛋白衍生物的核苷酸序列，该蛋白衍生物通过将 SEQ ID N0 :6所示的氨基酸序列的一个或多个氨基酸残基替换、缺失或插入而获得。 在本专利技术的一个具体实施例中，所述的核苷酸序列如SEQ ID N0 :5所示。 含有本专利技术所述的核苷酸序列的重组表达载体以及含有该载体的宿主细胞也在 本专利技术所保护的范围之内。 进一步的，本专利技术还提出了本专利技术所述的多表位重组抗原在制备预防牛A型口蹄 疫疫苗中的应用。及 所述的核苷酸序列在制备预防牛A型口蹄疫疫苗中的应用。 -种牛A型口蹄疫多表位疫苗，其特征在于含有本专利技术所述的多表位重组抗原。 在本专利技术的一个具体实施例中，所述的多表位疫苗还含有口蹄疫病毒3D蛋白的 全长氨基酸序列，所述的口蹄疫病毒3D蛋白的全长氨基酸序列如SEQ ID N0 :8所示。 本专利技术采用一抗原化抗体II策略以及全新的反向疫苗学技术和策略，将曾经在 我国流行的牛A型口蹄疫病毒代表性毒株的优势抗原表位进行合理的串联后，与牛IgG免 疫刺激片断（IgG重链恒定区）偶联，克隆入原核表达质粒如pET-30a ( + )构建重组表达质 粒，转化大肠杆菌感受态细胞（BL21、BL21 (DE3)或BL21 (DE3)pLys系列等）表达重组抗原 并采用Ni-NAT层析柱纯化后，经Bio-Rad蛋白定量试剂盒定量后单独或与重组口蹄疫病毒 3D蛋白配伍制备疫苗，动物免疫试验结果显示，该重组蛋白或配伍后的疫苗能够刺激机体 产生高效价的保护性抗体，同时能够保护免疫动物抵抗病毒的攻击，因而本专利技术具有良好 的应用前景。 【专利附图】【附图说明】 图1为重组表位抗原单独或与3D蛋白联合免疫豚鼠效力试验结果；结果显示，在 加强免疫后，抗原单独或与3D蛋白联合免疫豚鼠均能诱导机体产生高水平的中和抗体，第 二次加强免疫后血清抗体效价进一步升高，显示出该抗原具有良好的免疫原性； 图2为重组抗原免疫牛实验结果；结果显示，重组抗原能够诱导宿主动物产生口 蹄疫特异性中和抗体，加强免疫后，保护性抗体水平进一步升高。 【具体实施方式】 下面结合具体实施例来进一步描述本专利技术，本专利技术的优点和特点将会随着描述而 更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本专利技术的范围构成任何限制。本领域技术 人员应该理解的是，在不偏离本专利技术的精神和范围下可以对本专利技术技术方案的细节和形式 进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本专利技术的保护范围内。 实施例1牛A型口蹄疫多表位重组抗原的制备 1、A型口蹄疫病毒VP1基因本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种牛A型口蹄疫多表位重组抗原，其特征在于所述的重组抗原是将曾经在我国流行的牛A型口蹄疫病毒代表性毒株的优势抗原表位进行合理串联后，与牛IgG重链恒定区偶联后构建得到，所述的重组抗原含有以下（a）或（b）所示的氨基酸序列：（a）SEQ ID NO：6所示的氨基酸序列；或（b）将SEQ ID NO：6所示的氨基酸序列通过一个或多个氨基酸残基的替换、缺失或插入而获得的仍具有多表位抗原功能的蛋白衍生物。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：邵军军，常惠芸，陈建文，
申请(专利权)人：中国农业科学院兰州兽医研究所，
类型：发明
国别省市：甘肃;62