一种利用MFH融合蛋白制备GLP-1多肽或其类似物方法和应用技术

本发明专利技术公开了一种利用MFH融合蛋白制备GLP-1多肽或其类似物方法和应用，属于生物技术领域。GLP-1多肽或其类似物的MFH融合蛋白的结构式为MFH-DP-H6-E7-PEP，其中，MFH为蛋白融合载体；DP为甲酸水解位点；H6为组氨酸标签；E7为专一性蛋白酶切位点；PEP为GLP-1多肽或其类似物。将编码DP-H6-E7-PEP的DNA连接到pMFH质粒上再转入大肠杆菌，通过原核表达得到MFH-DP-H6-E7-PEP融合蛋白，利用甲酸水解、专一性蛋白酶水解和亲和层析得到GLP-1多肽或其类似物。本发明专利技术达到了多肽大规模高效表达、多肽释放工艺步骤少、条件温和、生产成本低的目的，适合工业化生产。

【技术实现步骤摘要】
一种利用MFH融合蛋白制备GLP-1多肽或其类似物方法和应用
本专利技术属于生物
，涉及重组多肽的制备，具体涉及一种利用MFH融合蛋白制备GLP-1多肽或其类似物方法和应用。
技术介绍
多肽是一类重要的生物分子，由小于80个氨基酸连接起来、呈一定空间结构的一类化合物。多肽参与生物体内各种细胞的生化反应过程，是人体最重要的功能调节剂之一。作为生物体内各种细胞功能的生物活性物质，多肽涉及到激素、神经、细胞生长和生殖等各个领域。与小分子化学药相比，多肽类药物往往更为安全、副作用更小，很少引起严重的免疫反应。多肽类物质分子结构小、易改造、易合成，已广泛应用于医药、食品、保健品、化妆品、生物材料、生物农药等众多领域，其中在医药行业应用领域主要包括多肽疫苗、多肽诊断试剂、多肽芯片、多肽药物等产品。随着化学和生命科学的进步，近年来多肽类药物的研发和上市出现了逐步加速的趋势。多肽类药物主要用于治疗癌症、代谢类疾病、心血管疾病和传染性疾病，内分泌类疾病、血液病和疼痛缓解等众多方向也都可应用多肽类药物。多肽药物的制备目前主要有化学合成、基因重组和从动植物组织细胞中提取三种方法。化学合成法中的固相多肽合成技术免去了液相多肽合成法过程中的纯化步骤，便于自动化操作，对多肽药物的规模发展起到了极大地推进作用。但是，对长度大于30个氨基酸的多肽，化学合成法有一定的困难，主要是产率低和成本高。在化学合成多肽药物快速成长之际，基因重组表达制备多肽药物也引起业内关注。与化学合成相比，基因重组方式更适于长肽的制备；而且随着技术的进步，以基因重组方式生产多肽药物的成本也在不断降低。化学合成和基因重组表达将在很长一段时间内成为互为补充的多肽药物生产方式。重组生产多肽拥有化学合成许多优点，包括产量高，成本低，易于规模化和减少对环境的污染。常用于重组多肽表达的宿主细胞有大肠杆菌、枯草杆菌和酵母菌等。由于在细胞内多肽的稳定性差，直接表达通常导致低收率，事实上表达在宿主细胞中的肽被内源性蛋白酶很快降解，由宿主细胞同化。为了克服这个问题，多肽通常以融合蛋白的形式表达。作为融合蛋白的一部分，肽可被定向到特定的细胞区室或以包涵体形式实现高产量表达和避免被细胞蛋白酶降解。用于多肽表达的融合载体已有许多已经商业化。例如GE公司的GST融合蛋白，NEB公司的MBP融合蛋白等为较大融合蛋白载体，Novagen公司的KSI为较小的融合蛋白，都已经商品化，在多肽制备方面的逐渐得到广泛应用。另外，GB1(US8221998)和MFH(US7390639)等较小的融合蛋白更具有产率高的优点。因此，裂解融合蛋白，有效释放多肽为重组多肽生产的一个重要关键技术。利用目前的化学裂解、蛋白酶水解融合蛋白小规模制备多肽(小于20毫克)较成功。但直接用于工业化生产临床需求多肽产品，仍不成功，如化学裂解法释放方法，易产生杂质多肽，严重影响后续纯化过程，而且，专一性较好的化学试剂溴化氰具有剧毒，工艺条件要求高，不适合工业化应用。酶法水解要求融合蛋白水溶性高，融合蛋白多是包涵体，无法直接溶于蛋白酶水解缓冲液。而且酶法水解需要专一的氨基酸序列。酶法水解工业化生产所需蛋白酶酶用量大，直接影响生产成本。目前广泛使用的专一性蛋白酶，如凝血酶、肠激酶、FactorXa来源单一，生产条件苛刻，产量低，无法满足工业化应用。虽然TEV蛋白酶可以大规模发酵制备，但同许多蛋白酶一样，水解产物仍然残留多余氨基酸。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种利用MFH融合蛋白制备GLP-1多肽或其类似物方法和应用。本专利技术的目的通过下述技术方案实现：一种GLP-1多肽或其类似物的MFH融合蛋白，其结构式为：MFH-DP-H6-E7-PEP。其中，MFH为蛋白融合载体；DP为L-天冬氨酸-L-脯氨酸序列；H6为组氨酸标签，序列为L-组氨酸1-L-组氨酸2-L-组氨酸3-组氨酸4-L-组氨酸5-L-组氨酸6；E7为专一性蛋白酶切位点，其序列为：L-谷氨酸1-L-天冬酰胺2-L-亮氨酸3-L-酪氨酸4-L-苯丙氨酸5-L-谷氨酰胺6-L-X，X为除脯氨酸以外的任意L-型氨基酸；PEP：为GLP-1多肽或其类似物，GLP-1多肽氨基酸序列见图1B及SEQIDNO.1，GLP-1的类似物为R34，即GLP-1的第34位赖氨酸置换成精氨酸，其氨基酸序列见图2B及SEQIDNO.2。本专利技术在融合蛋白载体MFH与目标多肽PEP之间以甲酸水解、亲和层析标签和蛋白酶氨基酸序列连接(DP-H6-E7)，整合了“融合蛋白甲酸水解、蛋白酶水解和亲和层析”优点，避免融合蛋白单一释放多肽工艺中融合蛋白不溶和多杂质的缺点。甲酸水解位点(DP)直接连接与融合蛋白载体之后，有利于多肽释放，释放的多肽易于溶于缓冲液，有利于后期蛋白酶水解工艺。上述GLP-1多肽或其类似物的MFH融合蛋白的制备方法为采用pMFH质粒在宿主菌中表达，具体包括如下步骤：(1)将编码DP-H6-E7-PEP的DNA序列连接到pMFH质粒上构建GLP-1多肽或其类似物的原核表达质粒pMFH-PEP。(2)将pMFH-PEP质粒转化到大肠杆菌BL21中得到表达融合蛋白MFH-DP-H6-E7-PEP的工程菌。(3)融合蛋白表达：将表达MFH-DP-H6-E7-PEP的工程菌培养至菌液OD600达到0.9～1.0时，添加诱导剂IPTG或乳糖继续发酵6小时以上，融合蛋白表达在包涵体中。其中，诱导剂为IPTG时，融合蛋白表达的方法优选为：将表达融合蛋白MFH-DP-H6-E7-PEP的工程菌接种于LB中，37℃培养到OD600值达到0.9～1.0时，添加诱导剂IPTG，终浓度为0.6～3mM，继续发酵10～12小时。诱导剂为乳糖时，融合蛋白表达的方法优选为：将表达融合蛋白MFH-DP-H6-E7-PEP的工程菌接种于发酵培养基中，37℃培养到OD600值达到0.9～1.0时，加入诱导前补液；1小时后，先后再加入乳糖诱导液、乳糖后补料液，继续发酵培养8～16小时。发酵培养基为：葡萄糖5g/L、酵母浸膏15g/L、酪蛋白水解物20g/L、氯化钠5g/L、硫酸铵1g/L、磷酸氢二钾5g/L、磷酸二氢钾2g/L、柠檬酸1g/L、硫酸镁0.5g/L，微量元素溶液1mL/L，用去离子水配制初始pH6.5～8.0；微量元素溶液为：硫酸亚铁3.2g/L、氯化亚锰1g/L、硝酸钴1.5g/L、氯化钙1g/L、氯化铜0.05～0.5g/L、硫酸锌0.4g/L、硼酸0.3g/L和钼酸钠0.8～4.2g/L溶于1mol/L盐酸中。诱导前补液为：葡萄糖300g/L、硫酸镁12g/L、氯化铵45g/L，用去离子水配制；乳糖诱导液为：乳糖180g/L、酵母浸膏180g/L、硫酸镁7g/L，用去离子水配制；诱导后补料液为：甘油300g/L、乳糖75g/L、硫酸镁7g/L，用去离子水配制。所述的GLP-1多肽或其类似物的MFH融合蛋白的制备方法还包括乙醇沉淀纯化，乙醇沉淀纯化具体包括如下步骤：(1)离心收集上述诱导表达的菌体，再用含6M尿素的PBS重悬菌体后进行破碎，离心收集总蛋白上清液。(2)往总蛋白上清液中加入等体积乙醇沉淀2～8小时，离心弃沉淀获取一次乙醇上清液。(3)往一次乙醇上清本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种GLP‑1多肽或其类似物的MFH融合蛋白，其特征在于结构式为：MFH‑DP‑H6‑E7‑PEP；其中，MFH为蛋白融合载体；DP为L‑天冬氨酸‑L‑脯氨酸序列；H6为组氨酸标签，序列为L‑组氨酸1‑L‑组氨酸2‑L‑组氨酸3‑组氨酸4‑L‑组氨酸5‑L‑组氨酸6；E7为专一性蛋白酶切位点，其序列为：L‑谷氨酸1‑L‑天冬氨酸2‑L‑亮氨酸3‑L‑酪氨酸4‑L‑苯丙氨酸5‑L‑谷氨酰胺6‑L‑X，X为除脯氨酸以外的任意L‑型氨基酸；PEP为GLP‑1多肽或其类似物，GLP‑1的类似物包括R34，GLP‑1多肽和R34的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.1和2所示。

【技术特征摘要】
1.一种GLP-1多肽或其类似物的MFH融合蛋白，其特征在于结构式为：MFH-DP-H6-E7-PEP；其中，MFH为US7390639B2中的蛋白融合载体；DP为L-天冬氨酸-L-脯氨酸序列；H6为组氨酸标签，序列为L-组氨酸1-L-组氨酸2-L-组氨酸3-组氨酸4-L-组氨酸5-L-组氨酸6；E7为专一性蛋白酶切位点，其序列为：L-谷氨酸1-L-天冬酰胺2-L-亮氨酸3-L-酪氨酸4-L-苯丙氨酸5-L-谷氨酰胺6-L-X，X为除脯氨酸以外的任意L-型氨基酸；PEP为GLP-1多肽或其类似物，GLP-1的类似物为R34，GLP-1多肽和R34的氨基酸序列分别如SEQIDNO.1和2所示。2.权利要求1所述的GLP-1多肽或其类似物的MFH融合蛋白的制备方法，其特征在于包括如下步骤：(1)将编码DP-H6-E7-PEP的DNA序列连接到pMFH质粒上构建GLP-1多肽或其类似物的原核表达质粒pMFH-PEP；(2)将pMFH-PEP质粒转化到大肠杆菌BL21中得到表达融合蛋白MFH-DP-H6-E7-PEP的工程菌；(3)融合蛋白表达：将表达MFH-DP-H6-E7-PEP的工程菌培养至菌液OD600达到0.9～1.0时，添加诱导剂IPTG或乳糖继续发酵6小时以上，融合蛋白表达在包涵体中。3.根据权利要求2所述的GLP-1多肽或其类似物的MFH融合蛋白的制备方法，其特征在于：诱导剂为IPTG时，融合蛋白表达的方法为：将表达融合蛋白MFH-DP-H6-E7-PEP的工程菌接种于LB中，37℃培养到OD600值达到0.9～1.0时，添加诱导剂IPTG，终浓度为0.6～3mM，继续发酵10～12小时；诱导剂为乳糖时，融合蛋白表达的方法为：将表达融合蛋白MFH-DP-H6-E7-PEP的工程菌接种于发酵培养基中，37℃培养到OD600值达到0.9～1.0时，加入诱导前补液；1小时后，先后再加入乳糖诱导液、乳糖后补料液，继续发酵培养8～16小时；发酵培养基为：葡萄糖5g/L、酵母浸膏15g/L、酪蛋白水解物20g/L、氯化钠5g/L、硫酸铵1g/L、磷酸氢二钾5g/L、磷酸二氢钾2g/L、柠檬酸1g/L、硫酸镁0.5g/L，微量元素溶液1mL/L，用去离子水配制初始pH6.5～8.0；微量元素溶液为：硫酸亚铁3.2g/L、氯化亚锰1g/L、硝酸钴1.5g/L、氯化钙1g/L、氯化铜0.05～0.5g/L、硫酸锌0.4g/L、硼酸0.3g/L和钼酸钠0.8～4.2g/L溶于1mol/L盐酸中；诱导前补液为：葡萄糖300g/L、硫酸镁12g/L、氯化铵45g/L，用去离子水配制；乳糖诱导液为：乳糖180g/L、酵母浸膏180g/L、硫酸镁7g/L，用去离子水配制；诱导后补料液为：甘油300g/L、乳糖75g/L、硫酸镁7g/L，用去离子水配制。4.根据权利要求2所述的GLP-1多肽或其类似物的MFH融合蛋白的制备方法，其特征在于还包括乙醇沉淀纯化，乙醇沉淀纯化包括如下步骤：(1)离心收集上述诱导表达的菌体，再用含6M尿素的PBS缓冲液重悬菌体后进行破碎，离心收集总蛋白上清液；(2)往总蛋白上清液中加入等体积乙醇沉淀2～8小时，离心弃沉淀获取一次乙醇上清液；(3)往一次乙醇上清液中加入等体积乙醇第二次...

【专利技术属性】
技术研发人员：苏正定，吴刚，赵以军，李祝，
申请(专利权)人：湖北工业大学，
类型：发明
国别省市：湖北;42