一种口蹄疫疫苗的制备方法技术

本发明专利技术提供了一种口蹄疫疫苗的制备方法。该方法包括以下步骤：(l)病毒的细胞培养液使用深层过滤装置以300L/m2/hr～500L/m2/hr的流速进行过滤；(2)使用中空纤维柱或膜包进行抗原液的超滤浓缩；(3)按照上述纯化浓缩方法获得的病毒抗原经过DEAE-Sepharose FF和Sephawse6FF两步层析柱；(4)使用二乙酰亚胺(BEI)灭活，硫代硫酸钠阻断；(5)使用206佐剂乳化。此方法制备的疫苗可使免疫动物获得免疫效果好、不良反应少、安全性高。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及，为一种新型的口蹄疫疫苗细胞培养液纯 化工艺。属于兽用生物制品制造领域。
技术介绍
口 蹄疫是由口蹄疫病毒（Foot-and-Mouth disease virus，FMDV)引起偶蹄动 物感染的一种急性、高度接触性、发热性传染病（Bachrach HL. Foot-and-mouth disease virus. Ann Rev Microbiol,1968, 22:201-244.)(Domingo E, Baranowski E, Escarrnrs C, etal. Foot-and-mouth disease virus.Comp. Immun. Microbiol-Infect. Dis，2002, 25:297-308.)，对养殖业危害极大，国际兽医局将其列为A类传染病之 首，是世界动物卫生组织（OIE)规定必报的传染病之一。FMDV属于小RNA病毒科， 口蹄疫病毒属，该病毒有七个血清型，分别为〇、A、C、SAT1、SAT2、SAT3和Asia 1型 (Martinez, MA, CarriloC, Plana J, MascarellaR, Bergada J1Palma EL1Domingo E, Sobrino F. Genetic and immunogenic variations among closely related isolates of foot-and-mouth disease virus · Gene, 1988, 62:75-84.)，其中在我国流行的主要是 0 型FMDV和Asia 1型FMDV。大多数发展中国家对FMD的预防和控制主要采用普遍免疫接种 的方法。目前我国广泛使用的FMD疫苗主要是灭活疫苗，研制安全、有效的FMD新型疫苗成 为各国研宄的重点。 现行口蹄疫病毒灭活疫苗免疫效力不稳定，疫苗注射后免疫持续期短，其 主要原因是疫苗中有效抗原（146S抗原）含量低（T R Doel. FMD vaccines. Virus Research, 2003, 91:81-89.)。为提高疫苗的免疫效力，通常采用对抗原浓缩的办法，常规方 法的缺点是有效抗原在纯化过程中的损失太大，不良反应得到改善但疫苗的免疫效果却降 低了。 生产中期望BHK21细胞病毒培养物的收获技术以高收率和最小细胞破裂的方式 操作。随着产物分子滴度的增加，较高的细胞团和较大量的产物对下游纯化步骤提出挑战， 较高的细胞团在澄清和无菌过滤期间造成困难，较高的产物浓度一般导致增加的杂质负 荷。目前，口蹄疫灭活疫苗仅用离心工艺技术去除有限的细胞碎片，该方法处理的口蹄疫病 毒细胞培养物含有非目的蛋白的大量残留，同时这一工艺方式使得抗原在处理过程中损失 较大，另外，离心清洁程序减慢工厂生产不同毒株口蹄疫病毒的能力，并且大大增加了生产 运行之间交叉污染的风险。
技术实现思路
本专利技术的技术方案为： 1. -种口蹄疫疫苗的制备方法，其特征在于该方法包括以下步骤：收获病毒的细 胞培养液，使用深层过滤装置进行过滤，滤液使用中空纤维柱或膜包进行超滤浓缩，经过两 步层析柱进行抗原纯化，过滤除菌后灭活、阻断，加206佐剂乳化，分装即得。 2.如权利要求1所述的口蹄疫疫苗的制备方法，其特征在于具体包括以下步骤： (1) 口蹄疫病毒细胞培养液经深层过滤装置处理，即：病毒细胞培养液与深层过 滤装置接触，以300L/m2/hr~500L/m 2/hr的流速过滤具有约0. 5pm~200pm的粒径分布的 细胞碎片和颗粒，分离目的抗原与细胞碎片和颗粒； (2)用中空纤维超滤系统或膜包浓缩纯化步骤（1)后抗原液； (3)按照上述纯化浓缩方法获得的抗原经过DEAE-Sepharose FF和Sephawse6FF 两步层析柱； (4)用二乙烯亚胺（BEI)处理（3)后抗原液进行灭活，硫代硫酸钠进行阻断； (5)抗原液灭活阻断后与206佐剂混合乳化制成双相油乳剂疫苗。 3.如权利要求1所述的，其特征在于所述深层滤器包 含至少2层非织造纤维的分级层，提供>100L/m 2/hr的通量，去除具有0. 5pm~200pm的粒 径分布的细胞碎片。 4.如权利要求1所述的，其特征在于步骤（2)所述使 用截留分子量为60kd~80kd的中空纤维柱或截留分子量为60kd~80kd的膜包进行浓缩 纯化，再用分子筛层析柱对滤液进行纯化。 5.如权利要求1所述的，其特征在于该方法用于制备 口蹄疫疫苗单价疫苗。 6.如权利要求1所述的，其特征在于该方法用于制备 口蹄疫疫苗多价疫苗。 本专利技术详细描述 为了完成上述技术方案，本专利技术提供了一种高效的口蹄疫病毒细胞培养液浓缩纯 化抗原工艺，包括以下步骤： 1.提供口蹄疫疫苗细胞培养液和深层过滤装置：料液与深层过滤装置接触，以 300L/m 2/hr~500L/m2/hr的流速过滤具有约0. 5pm-~200pm的粒径分布的细胞碎片和颗 粒，分离目的抗原与细胞碎片和颗粒。 (1)本专利技术提供一种深层过滤装置（瑞士 FILTR0X公司），AF103深层过滤滤滤 膜，包括具有1. 5~0. 5 μπι多个分级的深层滤器介质，用于初步澄清和去除聚集的细胞生 物质，提高未澄清的进料流的通量而没有不期望的滤饼过滤效应； (2)AF103滤膜有非常高的深度以分散细胞团，防止会导致介质中的内部滤饼过滤 的内部絮状物桥接，在介质的外部或内部以避免压力的浓度降低引起絮状物分解； (3)具有各向异性深层滤器层，即孔径逐步减少，匹配料液中絮状物大小的群体； (4)对于平均粒径大于10 μπι的目标抗原的初步澄清（通常是采用絮凝剂和化学 处理的料液的初步澄清）； (5) AF103滤膜具有开放标称孔径评级的非织造纤维和纤维素/硅藻土 (diamatoceous earth)的复合分级层，能够过滤具有大量固体的聚合物絮凝剂处理的进料 流； (6)AF103滤膜具有较大通透性，但对于聚合物絮凝剂处理的进料流有较好的保持 特性。 2.对经AF103滤膜过滤处理后的抗原液再用内径I. 0mm、截留分子量500KD、柱体 积51. 80cm2、规格3. 8X12寸的中空纤维超滤系统，采用阴离子交换层析和分子筛层析柱对 过滤的抗原液进行纯化。 较佳地步骤（3)中，用于口蹄疫病毒浓缩用中空纤维分子量规格为60K~80K ;当 循环液体积为原液体积的1/50~1/4,优选为1/20~1/10时，收集中空纤维超滤系统的循 环液，弃去透过液。 较佳地，中空纤维的数量为1000~4000根纤维/支膜柱，用于口蹄疫病毒中空纤 维膜柱数是40支。 较佳地，可使用膜包进行超滤浓缩，使用中空纤维柱可对病毒液进行50~200倍 的超滤浓缩，使用膜包进行的病毒液超滤浓缩可达50倍。 本专利技术所述的阴离子交换层析柱使用介质为DEAE-Sepharose FF，柱床体积约 10ml，线性流速为100cm/h。 本专利技术所述的聚丙烯酰胺葡聚糖凝胶为GE公司产品，组分收集范围为 1.0 X IO4~1.0 X 10 8球蛋白分子量的高分辨率的聚丙烯酰胺葡聚糖凝胶。更优选为组分 收集范围为I. ox IO4~1.0 X 10 6球蛋白分子量本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种口蹄疫疫苗的制备方法，其特征在于该方法包括以下步骤：收获病毒的细胞培养液，使用深层过滤装置进行过滤，滤液使用中空纤维柱或膜包进行超滤浓缩进行抗原纯化，过滤除菌后灭活、阻断，加206佐剂乳化，分装即得。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：何召庆，赵颖慧，张涛，李如珩，田普厚，赵炳武，刘彦涛，康斌，王永伟，张澍，
申请(专利权)人：北京健翔和牧生物科技有限公司，内蒙古必威安泰生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：北京;11