猪病毒性腹泻四种病原的液相芯片检测方法技术

猪病毒性腹泻四种病原的液相芯片检测方法，该方法首先分别针对病毒BVDV的Npro基因、TGEV的N基因、PEDV的M基因、PRoV的VP6基因序列设计、合成相应的上下游引物、探针，所有下游引物5’端进行生物素标记，所有探针5’端进行氨基(NH2(CH2)12修饰；选用不同颜色编码的微球分别偶联BVDV、TGEV、PEDV、PRoV的探针，将得到的四种偶联到微球的探针进行混合；再将生物素化的扩增产物与偶联到微球上的探针混合物杂交，得到的杂交产物进行液相芯片检测，根据MFI值判定检测结果，该方法可同时检测猪病毒性腹泻四种病原，特异性好，重复稳定性好，灵敏度高。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于病毒学
，具体涉及猪病毒性腹泻四种病原的液相芯片检测方法，更具体涉及一种能够同时检测猪病毒性腹泻四种病原的液相芯片检测方法。
技术介绍
猪病毒性腹泻疾病是由多种病毒引起的以腹泻、呕吐及脱水为主要临床症状的高度接触性腹泻疾病。猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪轮状病毒(PRoV)以及猪源牛病毒性腹泻病毒(BVDV)是引起该病的主要病原，各年龄猪均可感染，病死率高达100％。近年来，猪病毒性腹泻疾病的发病死亡率逐渐上升，而且由单一病原的感染发展为多病原的混合感染，给临床诊断带来困难，延误诊断时机，给养猪业带来了经济损失。目前，诊断该类病原的实验室常规检测方法有病毒的分离鉴定、ELISA、实时荧光定量PCR技术等，但这些方法存在实验周期长、操作繁琐、或者仅限单一病毒、或者2-3个病毒检测，没有同时检测以上四种病毒的技术。液相芯片技术也称微球体悬浮芯片技术，是20世纪90年代中期发展起来的一种以用荧光染色方法编码直径只有5.6μm的微球或6.5μm的磁性微球为核心的检测技术。相对于其他实验室检测技术，液相芯片技术具有通量高、灵敏度高、特异性强、应用范围广以及操作简便等无法比拟的优势。该项技术整合了应用流体学、微球编码、激光技术以及高速数字信号处理等先进技术，在特制的聚苯乙烯小球或磁性小球上包被核酸探针及抗原抗体等分子，在液相反应体系中可以同时检测多种成分，成为新型基因和蛋白组学中的研究工具，已经通过FDA认证，可直接用于临床诊断。液相芯片技术在核酸检测中主要有三种检测模式：直接DNA杂交、竞争性DNA杂交、酶反应beads杂交。直接DNA杂交是主流技术，其优点是操作简便且成本低。该项技术原理是以PCR来标记靶DNA，然后使其与偶联在磁珠上的互补探针进行直接杂交，最后加入荧光报告分子SA-PE(链酶亲和素-藻红蛋白)，用Luminex200系统检测，对所得平均中位荧光值(MFI)进行分析。在直接杂交之前，PCR产物需要进行生物素标记。生物素标记一般有两种方法：第一种是对引物进行标记，另一种是对扩增产物进行标记。研究者通常选用第一种方法，操作方便，而且一般对下游引物进行5’端生物素化，然后对保守性较好的300bp左右的DNA进行扩增，这样靶DNA反义链就标记上了生物素。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供猪病毒性腹泻四种病原的液相芯片检测方法，首先设计合成针对猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪轮状病毒(PRoV)以及猪源牛病毒性腹泻病毒(BVDV)的特异性探针及引物对，建立能够同时检测PEDV、TGEV、PRoV以及BVDV的检测方法，为临床样品检测提供一种新的检测方法，同时也为类似病毒的高通量检测提供借鉴。为达到上述目的，本专利技术的技术方案是：本专利技术利用液相基因芯片中的DNA直接杂交法原理，建立一种可以同时检测PEDV、TGEV、PRoV及BVDV的检测方法。首先分别设计四种病毒的特异性探针及引物对，然后分别进行PCR扩增，将PCR产物与成功偶联在微球上的探针进行直接杂交，最后加入荧光报告分子(SA-PE)，用Luminex200液相芯片分析检测仪进行测定，对所得MFI值进行分析。并通过对杂交温度、杂交时间以及上、下游引物的比例优化筛选，最后得出一个较为完整的检测体系。一种用于同时检测四种猪病毒性腹泻病原的液相基因芯片的引物对和探针，包括猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪轮状病毒(PRoV)以及猪源牛病毒性腹泻病毒(BVDV)的上、下游引物和探针，所有下游引物5’端进行生物素(Biotin)标记，所有的探针5’端进行氨基(NH2(CH2)12修饰，具体序列如表1所示。表1本专利技术所述四种猪病毒性腹泻病原的液相芯片检测方法，其包括如下步骤：1)以提取待测样品中的RNA作为模板，反转录得到cDNA；2)分别利用病毒BVDV的Npro基因、TGEV的N基因、PEDV的M基因、PRoV的VP6基因序列设计、合成相应的上下游引物、探针，各病毒上下游引物、特异性探针的具体序列如表1所示；3)微球与探针进行偶联选用不同颜色编码的微球分别偶联病毒BVDV的探针BN-Probe、病毒TGEV的探针TGEV-Probe、病毒PEDV的探针PM1-Probe、病毒PRoV的探针PVP6-Probe，将得到的四种偶联到微球的探针进行混合，备用；4)杂交以步骤1)得到的cDNA为模板，利用步骤2)合成的上下游引物分别进行PCR扩增，得到生物素化的扩增产物；将所述生物素化的扩增产物与步骤3)中偶联到微球上的探针混合物进行杂交反应；5)检测对步骤4)得到的杂交产物进行液相芯片检测，根据平均中位荧光强度值(MFI)判定检测结果：若待测样品相应病毒的MFI与阴性对照的MFI的比值≥3，则待测样品判定为该病毒阳性；若2≤待测样品相应病毒的MFI与阴性对照MFI的比值＜3，则待测样品判定为该病毒疑似阳性；若待测样品相应病毒的MFI与阴性对照MFI的比值＜2，则待测样品判定为该病毒阴性。进一步，所述微球是直径为6.5μM的磁性微球。步骤4)中，所述PCR扩增的扩增体系中上、下游引物的质量比为1：1～8。再，步骤4)中，所述PCR扩增的扩增体系中上、下游引物的浓度≥5μM。步骤4)中，所述PCR扩增的扩增反应程序中退火温度为50～56℃。优选的，步骤4)中，所述杂交反应的杂交温度为50～53℃，杂交时间为20～35min。更优选的，步骤4)中，所述杂交反应的杂交温度为50℃，杂交时间为35min。优选的，本专利技术所述微球是直径为6.5μM的磁性微球。本专利技术的有益效果：本专利技术成功建立了能同时检测猪病毒性腹泻四种病原的液相芯片检测方法，且该方法特异性好，重复稳定性好，灵敏度比现有多重PCR检测方法至少提高10倍。临床样品检测与现有PCR方法阳性符合率为100％，可以大规模应用于临床样品检测。说明书附图图1为本专利技术实施例2中扩增产物的PCR电泳图，其中，泳道1、2代表BVDV(+)、(-)，泳道3、4代表PEDV(+)、(-)，泳道5、6代表PRoV(+)、(-)，泳道7、8代表TGEV(+)、(-)。图2为本专利技术实施例4中44#微球偶联BVDV的探针BN本文档来自技高网...

【技术保护点】
用于同时检测猪病毒性腹泻四种病原的液相基因芯片的引物对和探针，其特征在于，包括猪流行性腹泻病毒PEDV、猪传染性胃肠炎病毒TGEV、猪轮状病毒PRoV以及猪源牛病毒性腹泻病毒BVDV的上、下游引物和探针，所有下游引物5’端进行生物素标记，所有探针5’端进行氨基NH2(CH2)12修饰，具体序列如下：BVDV：上游引物BN‑F:TTACGACATCAACGGAT；下游引物BN‑R:Biotin‑TGGTCCCTAGTCGCTCT；探针BN‑Probe:NH2(CH2)12‑CCGCAATCCACACTAAAGCTA；TGEV：上游引物TGEV‑F3:AACAGGGATCAACAGATT；下游引物TGEV‑R3:Biotin‑TAGTAGAAGAACCACCT；探针TGEV‑Probe:NH2(CH2)12‑CAAACTCGCTATCGCATGG；PEDV：上游引物PEDV‑F:GATACTTTGGCCTCTTGTGT；下游引物PEDV‑R:Biotin‑ATTGACTTACCTGTACGC；探针PM1‑Probe:NH2(CH2)12‑CGCAGGACACATTCTTGGT；PRoV：上游引物PVP6‑F3:ATTTATATTYCATGCTAC；下游引物PVP6‑R3:Biotin‑CTGTCCAATTCATYCCT；探针PVP6‑Probe:NH2(CH2)12‑TTTGTGAATCTGTGCTTG。...

【技术特征摘要】
1.用于同时检测猪病毒性腹泻四种病原的液相基因芯片的引物对和探
针，其特征在于，包括猪流行性腹泻病毒PEDV、猪传染性胃肠炎病毒
TGEV、猪轮状病毒PRoV以及猪源牛病毒性腹泻病毒BVDV的上、下
游引物和探针，所有下游引物5’端进行生物素标记，所有探针5’端进
行氨基NH2(CH2)12修饰，具体序列如下：
BVDV：上游引物BN-F:TTACGACATCAACGGAT；
下游引物BN-R:Biotin-TGGTCCCTAGTCGCTCT；
探针BN-Probe:NH2(CH2)12-CCGCAATCCACACTAAAGCTA；
TGEV：上游引物TGEV-F3:AACAGGGATCAACAGATT；
下游引物TGEV-R3:Biotin-TAGTAGAAGAACCACCT；
探针TGEV-Probe:NH2(CH2)12-CAAACTCGCTATCGCATGG；
PEDV：上游引物PEDV-F:GATACTTTGGCCTCTTGTGT；
下游引物PEDV-R:Biotin-ATTGACTTACCTGTACGC；
探针PM1-Probe:NH2(CH2)12-CGCAGGACACATTCTTGGT；
PRoV：上游引物PVP6-F3:ATTTATATTYCATGCTAC；
下游引物PVP6-R3:Biotin-CTGTCCAATTCATYCCT；
探针PVP6-Probe:NH2(CH2)12-TTTGTGAATCTGTGCTTG。
2.猪病毒性腹泻四种病原的液相芯片检测方法，其包括如下步骤：
1)以提取待测样品中的RNA作为模板，反转录得到cDNA；
2)分别针对病毒BVDV的Npro基因、TGEV的N基因、PEDV的M
基因、PRoV的VP6基因序列设计、合成相应的如权利要求1所述
的上、下游引物，探针；
3)微球与探针进行偶联
选用不同颜色编码的微球分别偶...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘惠莉，熊年年，陶洁，张春玲，李本强，
申请(专利权)人：上海市农业科学院，
类型：发明
国别省市：上海;31