一种TaqMan荧光定量PCR检测嵌合型猪圆环病毒1-2的方法技术

本发明专利技术公开了一种TaqMan荧光定量PCR检测嵌合型猪圆环病毒1-2的方法。该发明专利技术包括引物的设计、PCV1-2TaqMan实时荧光定量PCR反应体系及反应条件的优化。本发明专利技术建立的方法可快速、准确、高效地对PCV1-2进行检测和定量，节省人力、物力、财力。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种TaqMan荧光定量PCR检测嵌合型猪圆环病毒1-2的方法，属于实验室

技术介绍
猪圆环病毒病(PCVD)是由猪圆环病毒Ⅱ型(PCV2)引起的一类猪病的总称，主要包括断奶仔猪多系统衰竭综合征、猪皮炎肾病综合征、猪呼吸道疾病综合征和母猪的繁殖障碍症。PCVD现已在全世界范围内发生和流行，其发病率可达60％，死亡率3％-10％，发病严重地区猪场在暴发本病时死淘率达到40％左右，给世界养猪业带来了巨大的损失。为控制猪圆环病毒的流行传播，目前，商品化的全病毒灭活疫苗和亚单位疫苗已在世界各地养猪场应用，并取得较好的效果。但是这些疫苗接种成本较高，并不能完全阻断PCV2的传播。Fenaux等(0022-538X(2003)20-11232-12)用PCV2的ORF2基因替换PCV1的ORF2基因成功构建出对猪无致病性但有感染力的嵌合型猪圆环病毒1-2，并能诱导猪体产生针对PCV2的特异性抗体。研究表明嵌合型PCV1-2疫苗免疫猪群，能快速产生细胞免疫和体液免疫应答，有效抵御PCV2各种亚型的混合感染，并且可作为PCV2疫苗的候选毒株。目前，国内外无市售检测PCV1-2的试剂盒，又因PCV1-2与亲本PCV1和PCV2高度同源，传统PCR方法和荧光定量方法很难将三者区分开，只能通过测序鉴定。Opriessnig等(0264-410X(2010)37-5960-7)建立了PCV1-2的TaqManr>荧光定量PCR检测方法，其使用CALFluorOrange560作为5′端报告基团，但是国内这种荧光染料标记探针需要进口，价格高达万元，且合成的探针难以获得常规实验室现有荧光定量PCR仪支持。所以，在国内针对该病毒的鉴定面临费时、费力、费用高等问题，不能快速定量该病毒。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种TaqMan荧光定量PCR检测嵌合型猪圆环病毒1-2的方法。本专利技术通过对定量检测PCV1-2的TaqMan荧光定量PCR检测方法进一步的探索，设计了针对PCV1-2的特异性引物和探针，建立了PCV1-2TaqMan荧光定量PCR检测方法。该方法对于PCV1-2的检测特异性、灵敏度很高，与猪圆环病毒1型(PCV1)、猪圆环病毒2型(PCV2)和猪其它常见病毒核酸模板不发生交叉反应。实现本专利技术目的的技术解决方案是：设计一对嵌合型PCV1-2的特异性引物，横跨PCV1的ORF1和PCV2的ORF2，特异性的扩增PCV1-2基因291bp的条带，同时，在此区域PCV1的ORF1中设计一条以6-FAM荧光染料作为5′端报告基团的TaqMan探针，并构建重组质粒Teasy-PCV1-2-P，优化qPCR的反应条件和反应体系，建立嵌合型猪圆环病毒1-2TaqMan荧光定量PCR检测方法。具体方法如下：一种TaqMan荧光定量PCR检测嵌合型猪圆环病毒1-2的方法，包括以下步骤：(1)引物设计：设计一对引物横跨PCV1的ORF1和PCV2的ORF2区，并设计TaqMan探针；(2)PCV1-2病毒DNA的提取；(3)重组质粒Teasy-PCV1-2-P的构建：将步骤(2)中获得的病毒DNA使用步骤(1)设计的引物进行扩增，然后将得到的目的片段连入pGEM-TEasy载体，获得重组Teasy-PCV1-2-P质粒；(4)优化PCV1-2TaqMan实时荧光定量PCR反应条件及反应体系：通过比较探针浓度、引物浓度及循环条件对反应的扩增效率的影响，优化荧光定量PCR反应条件及反应体系；(5)建立定量PCR的标准曲线：将步骤(3)获得的重组质粒DNA作为定量PCR阳性模板，用超纯水以10倍稀释度进行倍比稀释，将其作为模板，用步骤(4)优化后的反应条件和体系进行TaqMan实时荧光定量PCR；(6)荧光定量PCR特异性的检测：以步骤(3)获得的重组质粒作为阳性对照，同时以其它非靶病毒DNA或cDNA为模板，超纯水作为阴性对照，用步骤(4)优化后的反应条件和体系进行TaqMan实时荧光定量PCR，观察是否有非特异性扩增；(7)荧光定量PCR敏感性的检测：将Teasy-PCV1-2-P重组质粒106-100个拷贝数/μl为模板，以超纯水作为阴性对照，用步骤(4)优化后的反应条件和体系进行TaqMan实时荧光定量PCR，检测其灵敏度；(8)荧光定量PCR重复性的检测：将Teasy-PCV1-2-P重组质粒稀释至104拷贝数/μl进行8次重复，用步骤(4)优化后的反应条件和体系进行TaqMan实时荧光定量PCR，间隔1个月后再将重组质粒稀释至104拷贝数/μl重复一次试验，计算2次试验Ct值的变异系数。其中，步骤(1)中所述上下游引物P1、P2和探针序列：P1：5′-GGCGTTCTGACTGTGGTTTT-3′P2：5′-TTTCTTGCTTGGCATTTTCA-3′探针序列：6FAM-CGCACTTCTTTCACTTTTATAGGATGACG-TAMRA该对引物能扩增出PCV1-2基因组中大小为291bp的DNA片段。步骤(4)中通过调整探针浓度、引物浓度及循环条件对反应的扩增效率进行优化，具体过程为：以108个拷贝/μl步骤(3)获得的标准品为模板，将探针和引物分别配制成30、20、15、10、5μmol/l，采用矩阵法筛选最佳探针和引物浓度。为了获得较稳定和较高的扩增效率，对TaqMan实时荧光定量PCR进行双温循环和三温循环筛选，同时将退火温度从53℃递增到60℃，对退火温度进行筛选。有益效果：本专利技术利用设计的针对PCV1-2的引物，可特异地扩增PCV1-2的基因序列，仅仅进行一个qPCR反应便可检测样本中的PCV1-2及其拷贝数，可节省传统测序鉴定方法所需的大量时间和费用。同时，我们使用的6-FAM作为探针荧光染料，与CALFluorOrange560荧光染料相比其价格低廉，合成价格不足千元，并可为常规实验室现有荧光定量PCR仪支持。所以，该方法的建立可对PCV1-2的进行快速高效的定量，节省大量时间和费用，且不受特定荧光定量PCR仪的限制，应用性极强，为PCV1-2提供了可靠的定量方法。附图说明图1是重组Teasy-PCV1-2-P质粒PCR扩增鉴定图。图2是TaqMan荧光定量PCR检测方法的标准曲线。图3是TaqMan荧光定量PCR检测方法的扩增曲线。图4是TaqMan荧光定量PCR检测方法的特异性。图5是TaqMan荧光定量本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种TaqMan荧光定量PCR检测嵌合型猪圆环病毒1‑2的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)引物设计：设计一对引物横跨PCV1的ORF1和PCV2的ORF2区，并设计TaqMan探针；(2)PCV1‑2病毒DNA的提取；(3)重组质粒Teasy‑PCV1‑2‑P的构建：将步骤(2)中获得的病毒DNA使用步骤(1)设计的引物进行扩增，然后将得到的目的片段连入pGEM‑TEasy载体，获得重组Teasy‑PCV1‑2‑P质粒；(4)优化PCV1‑2TaqMan实时荧光定量PCR反应条件及反应体系：通过比较探针浓度、引物浓度及循环条件对反应的扩增效率的影响，优化荧光定量PCR反应条件及反应体系；(5)建立定量PCR的标准曲线：将步骤(3)获得的重组质粒DNA作为定量PCR阳性模板，用超纯水以10倍稀释度进行倍比稀释，将其作为模板，用步骤(4)优化后的反应条件和体系进行TaqMan实时荧光定量PCR；(6)荧光定量PCR特异性的检测：以步骤(3)获得的重组质粒作为阳性对照，同时以其它非靶病毒DNA或cDNA为模板，超纯水作为阴性对照，用步骤(4)优化后的反应条件和体系进行TaqMan实时荧光定量PCR，观察是否有非特异性扩增；(7)荧光定量PCR敏感性的检测：将Teasy‑PCV1‑2‑P重组质粒106‑100个拷贝数/μl为模板，以超纯水作为阴性对照，用步骤(4)优化后的反应条件和体系进行TaqMan实时荧光定量PCR，检测其灵敏度；(8)荧光定量PCR重复性的检测：将Teasy‑PCV1‑2‑P重组质粒稀释至104拷贝数/μl进行8次重复，用步骤(4)优化后的反应条件和体系进行TaqMan实时荧光定量PCR，间隔1个月后再将重组质粒稀释至104拷贝数/μl重复一次试验，计算2次试验Ct值的变异系数。...

【技术特征摘要】
1.一种TaqMan荧光定量PCR检测嵌合型猪圆环病毒1-2的方法，其特征在于，包括以
下步骤：
(1)引物设计：设计一对引物横跨PCV1的ORF1和PCV2的ORF2区，并设计TaqMan
探针；
(2)PCV1-2病毒DNA的提取；
(3)重组质粒Teasy-PCV1-2-P的构建：将步骤(2)中获得的病毒DNA使用步骤(1)
设计的引物进行扩增，然后将得到的目的片段连入pGEM-TEasy载体，获得重组
Teasy-PCV1-2-P质粒；
(4)优化PCV1-2TaqMan实时荧光定量PCR反应条件及反应体系：通过比较探针浓度、
引物浓度及循环条件对反应的扩增效率的影响，优化荧光定量PCR反应条件及反应体
系；
(5)建立定量PCR的标准曲线：将步骤(3)获得的重组质粒DNA作为定量PCR阳
性模板，用超纯水以10倍稀释度进行倍比稀释，将其作为模板，用步骤(4)优化后的
反应条件和体系进行TaqMan实时荧光定量PCR；
(6)荧光定量PCR特异性的检测：以步骤(3)获得的重组质粒作为阳性对照，同时
以其它非靶病毒DNA或cDNA为模板，超纯水作为阴性对照，用步骤(4)优化后的反
应条件和体系进行TaqMan实时荧光定量PCR，观察是否有非特异性扩增；
(7)荧光定量PCR敏感性的检测：将Teasy-PCV1-2-P重组质粒106-100个拷贝数/μl为
模板，以超纯水...

【专利技术属性】
技术研发人员：高崧，俞天奇，张飞鹏，高清清，樊铭玉，
申请(专利权)人：扬州大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32