本发明专利技术公开了一种检测猪伪狂犬病毒抗体的试剂盒及阻断ELISA检测方法，包括辣根过氧化物酶标记的猪伪狂犬病毒单克隆抗体、猪伪狂犬病毒单克隆抗体是以猪伪狂犬病毒为免疫原得到的单克隆抗体、猪伪狂犬病毒为伪狂犬病毒鄂A株；试剂盒还包括酶标板、样品稀释液、阴（阳）性对照、显色液、洗涤液、终止液；其步骤：a、从试剂盒中取出预包被有病毒抗原的检测板，将稀释好的待检血清加入抗原包被板中，同时设阴、阳性对照孔；b、振匀孔中样品，甩掉板孔中的溶液，用洗涤液洗；c、每孔加酶标单抗，洗涤，加显色液，室温避光显色，加终止液，用酶标仪测定每孔OD630nm读值。该方法特异性好，灵敏度高。检测时间短；结果判定采用S/N比值法，准确性高。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及动物疫病检测，具体涉及一种检测猪伪狂犬病毒抗体的酶联免疫试剂盒，同时还涉及一种猪伪狂犬病毒抗体的阻断ELISA检测方法。适用于检测猪血清中的伪狂犬病毒抗体水平。
技术介绍
伪狂犬病(Pseudorabies，PR)是由伪狂犬病病毒(Pseudorabies Virus, PrV)引起的包括家畜和多种野生动物的一种以发热、奇痒及脑脊髓炎为症状的重要传染病。该病给养猪业造成了巨大的经济损失，猪是本病的天然宿主和储存者。预防、控制和最终根除该病是我国当前面临的一项艰巨任务。在伪狂犬病的防制工作中，监测和检测猪血清中伪狂犬病病毒抗体的水平是非常重要的一个环节。对于尚未接种的猪只，血清中的猪伪狂犬病病毒抗体既可能反映了母源抗体的影响，也可能反映了隐性感染的迹象。这两种情况都会影响到减毒活疫苗的接种效果，甚至可能使疫苗无效，无法产生对病毒的免疫保护，导致免疫失败。对于已经接种的猪只，血清中的猪伪狂犬病病毒抗体水平则反映了免疫的效果。目前国内检测猪伪狂犬病毒抗体一般采用乳胶凝集、间接ELISA方法等，这些方法敏感性不高，对抗原纯度要求却比较高，而真正意义上的纯抗原很难获得。因此不可避免会产生非特异性反应，对结果造成误判。本专利技术应用针对伪狂犬病毒的单克隆抗体及阻断ELISA检测技术，使试剂盒具有很好的敏感性和特异性。
技术实现思路
本专利技术的目的是在于提供了一种检测猪伪狂犬病毒抗体的酶联免疫试剂盒，该试剂盒的优点是使用了辣根过氧化物酶(HRP)标记的的单克隆抗体，提高了检测的灵敏性和特异性。本专利技术的另一个目的是在于提供了一种猪伪狂犬病毒抗体的检测方法。该方法将猪伪狂犬病毒作为抗原包被于ELISA板上，然后加待检血清孵育，再加入酶标记的猪伪狂犬病毒单抗，显色时应出现两种情况，如果待检血清是阳性，那么此时加入的酶标单抗就会被阳性血清中的抗体阻断，酶标仪检测数值就会越低。如果是待检血清阴性，那么酶标单抗就会继续与ELISA板上猪伪狂犬病毒抗原反应，得到的数值就会越高。其检测方法特异性好、敏感性高。与美国IDEXX公司猪伪狂犬抗体ELISA试剂盒的检测符合率为97%。有着良好的应用前景。为了实现上述的目的，本专利技术采用以下技术措施一种检测猪伪狂犬病毒抗体的酶联免疫试剂盒，包括辣根过氧化物酶标记的猪伪狂犬病毒的单克隆抗体，所述的猪伪狂犬病毒单克隆抗体是以猪伪狂犬病毒为免疫原得到的单克隆抗体，所述的猪伪狂犬病毒为伪狂犬病毒鄂A株(该伪狂犬病毒鄂A株来源见参考文献陈焕春等，猪伪狂犬病病毒鄂A株的分离鉴定，畜牧兽医学报，1998年02期)。所述的试剂盒还包括酶标板、样品稀释液、阳性对照、阴性对照、显色液A、显色液 B、洗涤液、终止液。所述的酶标板是以猪伪狂犬病毒在包被酶标板时用0. lmol/L, pH9. 6的碳酸氢钠溶液作为包被缓冲液。所述的阳性对照为猪伪狂犬疫苗免疫的猪阳性对照血清，所述的阴性对照为未感染过猪伪狂犬病毒的健康猪阴性血清。所述的洗涤液为含有0. 05% Tween-20的PBS缓冲液；所述终止液为含0. 25%体积比氢氟酸溶液。所述的显色液A为含有50mg/mL过氧化氢脲的柠檬酸盐缓冲液，显色液B液为含有0. 2mg/mL TMB pH5. 0的柠檬酸/柠檬酸钠缓冲液。所述的样品稀释液液为含2. 5mg/mL的明胶的DMEM培养基。所述的单克隆抗体，其制备过程是采用杂交瘤细胞技术，用纯化的猪伪狂犬病毒 (鄂A株)免疫BALB/c小鼠，取其脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞(SP2/0)进行细胞融合，用HAT 选择性培养基进行培养后，再用纯化的猪伪狂犬病毒包被板进行间接ELISA筛选，筛选的阳性细胞株经有限稀释法克隆，再用猪伪狂犬疫苗免疫的猪阳性对照血清和未感染过猪伪狂犬病毒的健康猪阴性血清进行阻断ELISA筛选，最终筛选到一株具有阻断效果的单克隆抗体，分泌此抗体的细胞株命名为PRV-GB。一种猪伪狂犬病毒抗体的阻断ELISA检测方法，其步骤是1)从试剂盒中取出预包被有病毒抗原的检测板(根据样品多少，可拆开分次使用)，将稀释好的待检血清(1 1稀释)100yL加入抗原包被板中，同时设阴、阳性对照孔， 各设2孔，每孔100 μ L。2)轻轻振勻孔中样品(勿溢出)，置37°C温育30分钟。甩掉板孔中的溶液，用洗涤液洗板5次，200 μ L/孔，每次静置3分钟倒掉，最后一次在吸水纸上拍干。3)每孔加酶标单抗100 μ L，置37°C温育30分钟。洗涤5次，方法同步骤2。每孔加显色液A、显色液B各一滴(50 μ L)，混勻，室温(18 25°C，以下相同)避光显色10分钟。每孔加终止液一滴(50 μ L)，15分钟内用酶标仪测定每孔OD63tlnm读值。本专利技术试剂盒判定标准为试验成立条件是阴性对照孔平均OD63tlnm值与阳性对照孔平均OD63tlnm值之差大于或等于0. 4。S =样品孔OD63tlnm值，N =阴性对照孔平均OD63tlnm值。 若S/N比值小于或等于0. 6，样品判为PRV抗体阳性。若S/N比值小于或等于0. 7但大于 0. 6，该样品必须重测，如果结果相同，则过一段时间后重新从动物取样进行检测。若S/N比值大于0. 7，样品判为PRV抗体阴性。本专利技术与现有技术相比，具有以下优点和效果1.由于酶标单克隆抗体的使用，特异性好，灵敏度高。2.检测时间短，一般1. 5个小时内即可出结果；3.结果判定采用S/N比值法，科学合理，准确性高。具体实施例方式实施例1 抗原包被板的制备病毒培养及纯化ΒΗΚ细胞用含10%小牛血清的DMEM于37°C培养，细胞长成单层后，倒掉上清，接种50分之1原体积的病毒，加维持液(含3%体积比小牛血清的DMEM)， 液体刚盖住细胞层即可，37°C吸附1小时后，添加维持液至原来培养细胞时的体积，37°C温箱继续培养，待80%以上细胞出现病变时，将细胞瓶置-20°C冰箱中，反复冻融3次，收集病毒液。收集的病毒液5000r/min 4°C离心30min去沉淀。上清用27000r/min 4°C离心1小时，沉淀用 anl pH7. 2 0. 01mol/L PBS 重悬。以 PBS 制备 20% (W/V，以下同)、；35%、45%和 60%的不连续梯度蔗糖，加样品至梯度界面上，4°C 27000r/min离心90min。收集45%浓度处的蛋白带至离心管中，用30ml PBS稀释重悬，27000r/min离心2小时脱糖。最后用2ml PBS悬浮沉淀。_20°C保存备用。将病毒抗原用pH9. 6的碳酸盐缓冲液稀释为500ng/mL，按100 μ L/孔加于聚苯乙烯微孔板中，4°C放置过夜.甩干；按150 μ L/孔用含5mg/mL BSA pH7. 4的磷酸盐缓冲液 4°C封闭1小时、甩干；按100 μ L/孔用含20%蔗糖pH7. 4的磷酸盐缓冲液室温保护3小时； 置干燥室干燥后，装入含干燥剂的包装中密封保存。实施例2 抗伪狂犬病毒单克隆抗体的制备及标记抗伪狂犬病毒单克隆抗体的制备步骤1)饲养细胞的制备在融合前一天，取一只7周龄雌性BALB/c鼠，颈椎脱臼处死， 75%体积比酒精消毒5min，甩干后移入超净工作台内，固定于经紫外消毒的泡沫板上，用灭菌眼科剪、弯头镊子剪开皮肤(不可损伤本文档来自技高网...
【技术保护点】
１．一种检测猪伪狂犬病毒抗体的酶联免疫试剂盒，其特征在于：包括辣根过氧化物酶标记的猪伪狂犬病毒的单克隆抗体、猪伪狂犬病毒单克隆抗体是以猪伪狂犬病毒为免疫原得到的单克隆抗体、猪伪狂犬病毒为伪狂犬病毒鄂Ａ株；所述的试剂盒还包括酶标板、样品稀释液、阳性对照、阴性对照、显色液Ａ、显色液Ｂ、洗涤液、终止液；所述的酶标板是以猪伪狂犬病毒在包被酶标板时用０．１ｍｏｌ／Ｌ，ｐＨ９．６的碳酸氢钠溶液作为包被缓冲液；所述的阳性对照为猪伪狂犬病毒免疫的高免血清；所述的阴性对照血清为未感染过猪伪狂犬病毒的健康猪血清；所述的洗涤液为含有０．０５％Ｔｗｅｅｎ－２０的ＰＢＳ缓冲液；所述终止液为含０．２５％体积比氢氟酸溶液；所述的显色液Ａ为含有５０ｍｇ／ｍＬ过氧化氢脲的柠檬酸盐缓冲液，显色液Ｂ液为含有０．２ｍｇ／ｍＬ ＴＭＢ ｐＨ５．０的柠檬酸／柠檬酸钠缓冲液；所述的样品稀释液液为含２．５ｍｇ／ｍＬ的明胶的ＤＭＥＭ培养基。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：但汉并，喻红燕，董晓辉，徐高原，金梅林，陈焕春，
申请(专利权)人：武汉科前动物生物制品有限责任公司，
类型：发明
国别省市：83
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