本发明专利技术提供了一种抗人肾损伤分子1（Kim-1）体外诊断试剂盒及其检测方法。该试剂盒主要包括：已包被单克隆第一抗体的96孔板；生物素标记的单克隆第二抗体；人肾损伤分子1的标准品；标记有辣根过氧化物酶的亲和素；底物；洗涤液；封闭液；终止液；该单克隆第一抗体，特异识别人肾损伤分子1的蛋白N端，其亲和力常数为5.3*10-9；该生物素标记的单克隆第二抗体含有生物素标记，特异识别人肾损伤分子1的蛋白C端，其亲和力常数为1*10-9。本发明专利技术提供的体外诊断试剂盒灵敏度高达10pg/ml.，检测范围可达10－12,000pg/ml，对Kim-1高度特异，准确性高，且稳定性好。采用该试剂盒进行体外诊断，简便快捷，无创伤，可以实现早期诊断及预后评估急性肾损伤（AKI）。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及医学和体外诊断技术，具体涉及，属于免疫生物学领域。
技术介绍
肾损伤分子1 (Kim-1 )1998年由Jos印h Bonventre教授实验室首先从缺血性肾损伤的大鼠中克隆，后由多家制药公司通过基因芯片的方法在药物诱导的大鼠急性肾损伤模型中得以验证。由于肾损伤分子I(Kim-I)也在Thl和Th2淋巴细胞表面有低表达，因而又被命名为T淋巴细胞免疫球蛋白粘蛋白分子I(TIM-I)和甲型肝炎病毒受体l(HAVCR-l)。 RNA印迹杂交分析结果表明，肾伤分子1在胎肝、胎肾中不表达，在正常成人肝、肾、脾有微弱表达，而在缺血损伤后的肾组织中表达显著增强。免疫组织化学染色及RNA原位杂交均显示，肾损伤分子1 (Kim-1) mRNA及蛋白分子表达于外髓部外层及皮质髓射线的近曲小管 S3区再生上皮细胞中，亚细胞定位于基底膜细胞顶部。人肾损伤分子1 (Kim-I)定位于染色体5q33. 2区域，表达2种同源蛋白Kim-Ia和Kim-lb。Kim-Ia和Kim-Ib除胞内C端略微不同外，其它部分完全一致。肾损伤分子Ia其C末端缺少酪氨酸激酶磷酸化区，主要在肝脏表达。肾损伤分子Ib在350位含一个酪氨酸激酶磷酸化位点，主要在肾脏表达。结构上，肾损伤分子(Kim-I)是I型膜性糖蛋白，分子量为104KD，分为胞外区，跨膜区和胞内区。其胞外部分由一个含6个胱氨酸的类免疫球蛋白结构域，2个N糖基化位点和1个富含苏氨酸/丝氨酸和脯氨酸的结构域组成，具有典型的粘蛋白样0-糖基化蛋白特征。其胞内区很短，但至少含有1个酪氨酸磷酸化位点，可通过磷酸化酪氨酸残基进行信号转导。当发生肾损伤时，肾损伤分子1的细胞外域在金属基质蛋白酶的作用下可在跨膜区附近裂解为可溶性片段(90KD)释放人细胞外，并排人尿中，该片断的生理功能目前仍不清楚。进一步研究表明，肾损伤分子1 (Kim-I)在免疫应答，肾脏肿瘤发生和肾间质纤维化的病理方面都有重要作用。由于肾损伤分子I(Kim-I)只在损伤的肾小管上皮细胞中表达，很多研究结果都认为其可以成为一个敏感的肾损伤标记物。在小鼠实验中结果发现，无论是缺血性肾损伤还是药物毒性肾损伤，尿中肾损伤分子1 (Kim-I)的水平与肾损伤的严重程度高度相关。而当肾损伤程度减轻或经干预治疗后，尿中肾损伤分子1水平则会下降。与此同时，肾损伤分子1 (Kim-I)还能对肾损伤的预后提供预测价值。Liangos等人在对201例住院患者的研究结果中发现，肾损伤分子1水平与患者预后的严重程度密切相关；在一项单中心的研究结果中，急性肾小管坏死患者尿中肾损伤分子1水平高于正常水平12倍。而在慢性肾损伤小鼠模型中，蛋白尿严重的小鼠其肾损伤分子1水平较高，提示发展至终末期肾病的风险增大。而目前尚缺乏有关蛋白尿与尿中肾损伤分子1水平相关性的大型队列研究。肾损伤分子1 (Kim-I)还能对移植肾功能的预后进行评估。有研究结果发现，在近端肾小管上皮细胞中肾损伤分子1表达越多，其移植肾功能恢复越好；而对145例肾移植患者移植肾功能与尿中肾损伤分子ι水平的随访研究结果中发现，肾损伤分子1 (Kim-I)水平越高，其移植肾功能往往不佳甚至完全丧失功能。综上所述，作为一个无创且敏感的肾损伤标记物，肾损伤分子1 (Kim-I)不仅可用于急性和慢性肾损伤的早期诊断及治疗监测，还可用于药物研发过程中化合物肾脏毒性监测或临床用药的肾毒性监测。而最近Han等提出来将肾损伤分子1 (Kim-I)联合其他肾损伤标记物(如中性粒细胞明胶酶脂质运载蛋白NGAL、白细胞介素18、谷胱甘肽S-转移酶等分子)共同对肾损伤进行更为精确的预测。同时对其在肾小管上皮细胞修复过程中的作用研究，特别是通过抗体或者相关因子来改变肾损伤分子1的表达和释放过程也将为肾损伤的治疗策略提供药物靶点。尽管多项研究表明肾损伤分子1 (Kim-I)极有希望成为一项无创，早期诊断及预后评估急性肾损伤(AKI)的新型实验室指标，但由于其在正常人尿液中表达量极低< Ing/ ml, 一般的实验室和临床检测试剂很难满足该项检查的要求。因此，肾损伤分子1 (Kim-I)的检测要成为一项常规临床检查技术，迫切需要解决以下三个问题1)开发特异性好，敏感性高，简便易行的临床检测技术，2)建立标准化检测试剂及检测流程以便各个研究和临床实验室之间进行交流3)建立健康人尿液肾损伤分子 1 (Kim-I)正常值区间。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种抗人肾损伤分子1 (Kim - 1)的体外诊断试剂盒(酶联免疫法)及检测方法，采用该方法进行体外诊断，特异性好，敏感性高，简便易行，可以实现无创伤，早期诊断及预后评估急性肾损伤(AKI)的新型实验室指标。为达到上述目的，本专利技术提供了一种抗人肾损伤分子1的体外诊断试剂盒，该试剂盒包含已包被单克隆第一抗体的96孔板； 生物素标记的单克隆第二抗体； 人肾损伤分子1的标准品； 标记有辣根过氧化物酶的亲和素； 底物； 洗涤液； 封闭液； 终止液；所述的单克隆第一抗体，特异识别人肾损伤分子1的蛋白N端，其亲和力常数为 5. 3*1(Γ9 ；所述的生物素标记的单克隆第二抗体含有生物素标记，特异识别人肾损伤分子1的蛋白C端，其亲和力常数为1*10_9。上述的抗人肾损伤分子1的体外诊断试剂盒，其中，所述的已包被单克隆第一抗体的96孔板是通过人肾损伤分子1的单克隆第一抗体包被96孔酶标板制成。本专利技术还提供了一种采用所述的抗人肾损伤分子1的体外诊断试剂盒体外检测抗人肾损伤分子1的检测方法，该方法包含以下步骤步骤1，建立检测标准曲线以人肾损伤分子1的标准品的浓度为纵坐标，光密度值为横坐标，在对数坐标纸上绘出标准曲线；步骤2，向已包被单克隆第一抗体的96孔板中加入洗涤液洗涤，然后，加入封闭液室温孵育1小时；步骤3，加入洗涤液洗涤，然后加入待测样品，室温孵育2小时； 步骤4，加入洗涤液洗涤，然后加入所述的生物素标记的单克隆第二抗体，室温孵育2 小时；步骤5，加入洗涤液洗涤，然后加入标记有辣根过氧化物酶的亲和素，室温避光孵育 20分钟；步骤6，加入洗涤液洗涤，然后加入底物溶液，室温避光孵育20分钟，显色； 步骤7，加入反应终止液；步骤8，通过酶标仪读取光密度值，根据步骤1所绘的标准曲线算出人肾损伤分子1含量。上述的诊断抗人肾损伤分子1的检测方法，其特征在于步骤3所述的待测样品包含培养细胞上清、细胞和组织裂解液、人血清和人尿液。本专利技术提供的抗人肾损伤分子1 (Kim-I)的体外诊断试剂盒包含特异识别重组和天然人肾脏损伤分子1的一对高亲和力抗体，与目前市场上少数几个供研究使用的人肾脏损伤分子1 (Kim-I)试剂盒相比，本专利技术试剂盒的检测灵敏度和检测范围大大增加。本专利技术提供的体外诊断试剂盒灵敏度高达10pg/ml.，检测范围可达10 - 12,000 pg/ml，对 Kim-I高度特异，准确性高，且稳定性好在室温可稳定存放一天，在4°C可稳定存放六个月；在-20°C和_80°C可反复冻融3次；_20°C反复冻融后检测效果为81. 6 %到98. 0 %。采用本专利技术试剂盒检测20个健康志愿者尿液中的肾损伤分子1 (Kim-I)含量为 60 - 850 pg/ml，作为正常值可信区间。采本文档来自技高网...
【技术保护点】
１．一种抗人肾损伤分子１的体外诊断试剂盒，其特征在于，该试剂盒包含：已包被单克隆第一抗体的９６孔板；生物素标记的单克隆第二抗体；人肾损伤分子１的标准品；标记有辣根过氧化物酶的亲和素；底物；洗涤液；封闭液；终止液；所述的单克隆第一抗体，特异识别人肾损伤分子１的蛋白Ｎ端，其亲和力常数为５．３＊１０－９；所述的生物素标记的单克隆第二抗体含有生物素标记，特异识别人肾损伤分子１的蛋白Ｃ端，其亲和力常数为１＊１０－９。
【技术特征摘要】
...
【专利技术属性】
技术研发人员：刘嵩凯，赵勇，陈成，
申请(专利权)人：上海华谷生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：31
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