本发明专利技术提供了一种乳腺癌检测试剂盒，该试剂盒包括有鼠抗人SPA-1单克隆抗体。本发明专利技术揭示乳腺癌患者乳腺组织癌细胞中特异性高表达SPA-1蛋白分子，并且其表达程度与乳腺癌细胞的转移能力密切相关，在级别不同的乳腺癌组织中表达也有明显差异，且SPA-1在正常组织、癌旁组织、癌组织表达有明显的组织特异性，进一步在细胞系水平上的研究表明SPA-1可以促进乳腺癌细胞的转移能力。本发明专利技术以SPA-1作为乳腺癌及其癌细胞转移检测的生物标记，提供包括鼠抗人SPA-1单克隆抗体的试剂盒，利用免疫组织化学方法检测乳腺癌患者肿瘤组织SPA-1表达水平。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物技术和医学领域，具体涉及乳腺癌检测技术。
技术介绍
乳腺癌是威胁女性健康的主要恶性肿瘤，全世界每年有四十多万妇女死于乳腺癌起因的疾病，在我国乳腺癌发病率已从五年前十万分之十七增加到2006年的十万分之五十，以每年3% -4%的速度急剧增长，目前约有接近50万患者。乳腺癌发生和转移受环境和遗传因素二者共同作用，复杂的发病机制是长期困扰医学界的一大难题。因此，发现预测和早期诊断乳腺癌发生转移的特异标记物是防治这类重大疾病的关键所在。目前，对乳腺癌的预警和早期诊断的技术主要有以下三种。1)临床体格检查定期接受临床体格检查是早期发现乳腺癌的有效方法之一。始于1963年纽约的健康保险计划(HIP)，历经18年研究发现，接受定期临床体格检查的妇女乳腺癌死亡率比对照组低 23%。我国也开展了一系列乳腺癌的预防工作，但是，由于乳腺癌普查耗资巨大，成本/效果比高，因此，我国乳腺癌早期发现主要着眼于自我检查和提高自身保健意识，但患者偶尔触及肿块而就诊，常常为时过晚。2)影像学诊断法影像学检查是以钼靶X线摄片为主要手段，辅以超声扫描和MRI扫描。钼靶X线摄片最早开始于1960年，在近五十年的发展历程中，对乳腺癌的早期诊断起到重要作用。乳腺组织本身密度小，包括肿瘤在内的很多病变表现为微小钙化。钼靶X线摄片方法能发现细小钙化点，如果表现为泥沙样钙化或细颗粒样钙化，或者每lcm2内< 0.5mm的超过5枚则可提示乳腺癌。但对于不典型的病变，尤其是致密型乳腺内的病变及近胸壁的病变易漏诊。2005年国际上乳腺癌诊疗领域的23位专家在肯定钼靶X线摄片技术在乳腺癌早期诊断的重要地位的同时，建议结合超声，MRI和病理检查，进行最佳评价。虽然该方法在发达国家乳腺癌的普查和早期发现中起到很大作用， 尤其是乳腺MRI技术的应用，将诊断敏感率提高至77 % -100 %，但是由于特殊仪器的限制， 对诊断技术的高要求和昂贵的价格，使这些方法在发展中国家及地区得不到广泛应用。3) 生物靶标早期检测包括乳腺癌相关基因普查，例如BRCAl和BRCA2的突变分析；乳头溢液特异物检测及血清肿瘤标志物的测定。Her-2/neu癌基因在乳腺癌中过度表达，在血清中可以检测到Her-2蛋白片断。通过酶联免疫反应测定血清Her_2水平，可以作为诊断乳腺癌的指标之一。因此，重点发展生物靶标检测，寻找新的乳腺癌检测靶标并发展为可供临床检测且简单实用的技术对于乳腺癌患者提前预警及采取有效的治疗手段意义重大。SPA-I 蛋白分子，艮口 signal-induced proliferation-associated protein l(SPA-l)，信号诱导的增殖相关蛋白1，是Ras超家族成员Rapl和Rap2的GTP酶活化蛋白，促使其由活性形式向非活性形式转变。小分子G蛋白Rapl在调控细胞增殖、分化、细胞粘附、肿瘤细胞浸润癌细胞转移中发挥重要作用。接受外来刺激而活化的Rapl 可通过Raf/ERK、ρ 38MAPK/CREB和P11调节造血细胞增殖和恶性转型，并能由内而外调节htegrin介导的粘附作用参与肿瘤细胞浸润。越来越多的研究表明， SPA-I与癌细胞转移密切相关。统计学分析发现SPA-I和MMP9多态性与早期宫颈癌淋巴结转移风险增高相关。并且SPA-I在高转移的前列腺癌组织中表达有明显差异，有研究表明 SPA-I可以促使转录因子Brd4出核而引起ECM相关基因表达降低，最终导致前列腺癌细胞转移o
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种乳腺癌检测试剂盒。实现本专利技术的技术方案是本专利技术提供的这种乳腺癌检测试剂盒包括鼠抗人SPA-I单克隆抗体。该乳腺癌检测试剂盒还可以包括封闭液、工作液、抗体稀释液、Bio-羊抗小鼠IgG浓缩液、SABC-POD浓缩液、20XDAB显色液A、20XDAB显色液B，所述的封闭液是用磷酸盐缓冲液PBS作为溶剂配制的5% (W/V)牛血清蛋白(BSA)溶液；所述的工作液是用PBS溶液作为稀释液将30% H2O2溶液稀释为3% (V/V)的H2O2溶液；所述的抗体稀释液为含有0. 1% (V/V)Tween-20的磷酸盐缓冲液(PBS)。本专利技术提供的乳腺癌检测试剂盒，还可以有以下试剂中的一种或几种或全部pH为7. 2-7. 4，浓度为0. Olmol/L的磷酸盐缓冲液(PBS)；pH为6. 0，浓度为0. Olmol/L的柠檬酸钠缓冲液，苏木素染液；中性树脂；75%(V/V)乙醇;95%(V/V)乙醇;无水乙醇；二甲苯。该试剂盒保存方法鼠抗人SPA-I单克隆抗体需4°C保存，其它试剂若长期储存需放于-20°C，短期储存可放于4°C以方便使用。本专利技术检测试剂盒的乳腺癌检测标签SPA-I蛋白分子，是一种具有GTP酶活性的调控分子，主要通过调控小G蛋白Rapl信号通路而参与细胞的生长、粘附、肿瘤发生等生理过程。本专利申请的专利技术人通过常规免疫组织化学染色和免疫蛋白质印迹等技术，首次发现乳腺癌患者在正常和癌旁组织细胞中SPA-I蛋白不表达或呈低表达，而在肿瘤细胞中则呈现高表达(见附图1)。进而选取64例已经确诊为不同病理级别的浸润性导管癌患者的组织切片经SPA-I染色后分级并经过统计学分析，发现SPA-I在不同分期的乳腺癌病理组织中表达水平有显著差异(P < 0. 05)。在体外细胞转移实验中，通过RNA干扰手段特异性降低内源性高表达的SPA-1，原本高转移能力的MDA-MB-231细胞迁移能力显著降低(见附图2)。综上表明，SPA-I蛋白在乳腺癌的恶化转移中发挥重要作用，而其表达的这种显著差异也为我们将其应用于临床诊断乳腺癌提供佐证。SPA-I蛋白氨基酸序列如序列表中的序列1所示(来自UniProKB，> sp | Q96FS4)。本申请专利技术人首次发现并证实乳腺癌患者乳腺组织癌细胞中特异性高表达SPA-I 蛋白分子，并且其表达程度与乳腺癌细胞的转移能力密切相关，因而临床上可以利用免疫组织化学方法检测乳腺癌患者肿瘤组织SPA-I的表达水平，从而用于乳腺癌及转移的诊断。以甲醛固定石蜡包埋的组织切片为例，本专利技术检测试剂盒的使用方法如下(1)脱蜡至水切片依次浸没在二甲苯中5分钟，二甲苯中5分钟，无水乙醇中 5min，95%乙醇中5min，75%乙醇中5min，PBS溶液中5分钟。(2)封闭内源性酶活在切片上滴加3% H2O2，可覆盖整张组织切片。室温放置10 分钟以灭活内源性辣根过氧化物酶。之后将切片浸没于PBS溶液中洗3次，每次5分钟。(3)抗原修复将切片浸入0. OlM柠檬酸钠缓冲液中，放入盛有适量蒸馏水的高压锅中，当其排气阀冒气后开始计时5-10分钟。冷却后浸没于PBS溶液中洗涤3次，每次5 分钟。(4)封闭在切片上滴加封闭液，可覆盖整张切片，室温放置30分钟。之后甩去多余液体。(5) —抗用抗体稀释液将鼠抗人SPA-I单克隆抗体按1 100_1 500稀释(经过稀释的抗体可在4°C短期保存)后，加在切片组织上，37°C放置1个小时或4°C过夜。然后浸没于PBS洗涤3次，每次5分钟。(6) 二抗用抗体稀释液将Bio-羊抗小鼠IgG浓缩液按1 100_1 500稀释为工作液(此工作液可在4°C短期保存)，加在本文档来自技高网...
【技术保护点】
１．一种乳腺癌检测试剂盒，包括鼠抗人ＳＰＡ－１单克隆抗体．。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：苏莉，夏和顺，张义磊，张茜，
申请(专利权)人：华中科技大学，
类型：发明
国别省市：83
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