一种肝癌诊断组合及含有该组合的试剂盒制造技术

本发明专利技术提供一种肝癌诊断组合及含有该组合的试剂盒，可有效提高肝癌尤其是原发性肝细胞肝癌的检测效率和准确率。本发明专利技术肝癌诊断组合，包括血清lncRNA hPVT1和uc002mbe.2，以及AFP。本发明专利技术血清lncRNA联合AFP组成的肝癌诊断组合在肝癌患者血清中的水平高于健康人。本发明专利技术血清lncRNA-hPVT1和uc002mbe.2联合AFP组成的肝癌诊断组合检测灵敏度和特异度高，能够及时反映肝癌患者的疾病状态，避免既往繁杂检测，节约时间人力成本。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种肝癌诊断组合及含有该组合的试剂盒，具体涉及一个用于原发性肝细胞肝癌预警以及早期诊断试剂盒的应用，属于生物医学诊断领域。
技术介绍
当今世界范围内，肝细胞肝癌(HCC)有很高的发病率和死亡率。尤其是在中国，由于乙肝病毒的广泛流行，肝癌是我国常见的恶性肿瘤，死亡率位居第二，HCC患者的数量大约占了全球患者数量的一半。虽然目前我国的肿瘤诊断和治疗手段较以前明显提高，但是大部分的的患者在确诊时已处于中晚期，丧失了最佳的治疗机会。因此肝癌的早期诊断，早期治疗显得尤为重要，是增加肝癌患者生存率，降低肝癌死亡率最有效的途径。但是，目前尚缺乏较为灵敏的HCC早期诊断手段，以及十分有效的治疗方法，从而导致其预后较差。AFP是目前最常用的肝癌筛查指标，但是越来越多的证据表明其灵敏度和特异度并不理想。长链非编码RNA(lncRNA)被发现与肝癌的发生发展有着密切的关系，并且可以在血清中稳定存在并被检测，符合临床标志物的要求。因此，我们对HCC患者血清中lncRNA的表达情况进行了检测，并建立区分肝癌患者与健康人的早期诊断试剂盒。实时定量PCR技术是近年来发展起来的一项对基因表达进行定量的新方法。目前real-timeQ-PCR所使用的荧光化学方法主要有五种，分别是：DNA结合染色，水解探针，分子信标，荧光标记引物，杂交探针。它们又可分为扩增序列特异和非特异的检测两大类。扩增序列非特异性检测方法的基础是DNA结合的荧光分子，如SYBRgreen1等荧光染料。扩增序列特异性检测方法是在PCR反应中利用标记荧光染料的基因特异寡核苷酸探针来检测产物，如TaqMan探针法。TaqMan探针法是使用5’端带有荧光物质(如：FAM等)，3’端带有淬灭物质(如：TAMRA等)的TaqMan探针进行荧光检测的方法，该方法灵敏度及特异度均较好。当探针完整时，5’端的荧光物质受到3’端的淬灭物质的制约，不能发出荧光。而当TaqMan探针被分解后，5’端的荧光物质便会游离出来，发出荧光。当PCR反应液中加入荧光探针后，在PCR反应的退火过程中，荧光探针便会和模板杂交。进一步在PCR反应的延伸过程中，TaqDNA聚合酶的5’→3’Exonuclease活性可以分解与模板杂交的荧光探针，游离荧光物质发出荧光。通过检测反应体系中的荧光强度，可以达到检测PCR产物扩增量的目的。
技术实现思路
本专利技术的目的是针对以上要解决的技术问题，提供一种肝癌诊断组合及含有该组合的试剂盒，本专利技术诊断组合包括血清lncRNAhPVT1和uc002mbe.2，以及AFP，可有效提高肝癌尤其是原发性肝细胞肝癌的检测效率和准确率。为实现上述技术目的，本专利技术提供了一种肝癌诊断组合，包括血清lncRNAhPVT1和uc002mbe.2。所述血清lncRNAhPVT1和uc002mbe.2在肝癌患者血清中的水平高于健康人。所述肝癌为原发性肝细胞肝癌。具体而言，本专利技术通过以下步骤得到了上述由血清lncRNA分子hPVT1和uc002mbe.2组成的肝癌诊断组合：1.通过在NCBI数据库检索，筛选出31个肿瘤相关的lncRNA分子作为候选血清lncRNAs(见表一)；2.实时荧光定量PCR在11个肝癌患者术前血清样本和10个健康人血清样本中检测候选血清lncRNAs；3.将步骤2中能够检测到的血清lncRNA在31个肝癌患者术前血清样本和31个健康人血清样本(包括步骤2中的样本)中用实时荧光定量PCR检测，找出在患者与正常人中有差异表达的血清lncRNA分子；4.将步骤3中检测到的有表达差异的血清lncRNA分子在另外40个肝癌患者术前血清样本和33个健康人血清样本中用实时荧光定量PCR检测。5.用RocheCobas8000机器检测步骤3和4中所有样品的AFP表达水平。对实验结果进行分析及相关统计显示：上述步骤2中，专利技术人通过实时荧光定量PCR筛选确定了25个候选lncRNAs(见表一)；在步骤3中验证了8个候选lncRNAs在肝癌患者与健康人血清中的表达水平不同，分别为ATB,EBIC,hDREH,PVT1,SRHC,RERT,uc002mbe.2和CUDR，其中ATB,EBIC,hDREH,PVT1,SRHC,RERT,uc002mbe.2在肝癌患者中表达上调，CUDR表达下调，由于RERT的检出率不到50％，所以再进一步的研究中将其排除；在步骤4中进一步检测了步骤3中筛选出的7个lncRNAs的表达水平，并将步骤3和4所有的样本合并，通过逐步回归的方法确立了区分肝癌与非癌对照的最优血清lncRNA组合，包括lncRNA分子hPVT1和uc002mbe.2，计算ROC下面积(AUC)来表示诊断效力的大小，其AUC为0.764，灵敏度60.56％，特异度90.62％(表2)；并采用十折交叉验证的方法对结果进行了检验，交叉检验结果AUC为0.744。本专利技术的诊断方法不受患者感染乙肝病毒状态的影响，患者无论是否感染乙肝病毒，均可采用此方法进行诊断(图1)。上述用于检测lncRNA分子在血清中水平的实时荧光定量PCR方法及相关试剂，为本领域现有技术。通过内源参照GAPDH校准，得到上述2个目标基因在待检血清标本中的水平2-ΔCt(ΔCt＝Cttaget-Ctreference)；ValuelncRNA＝2-ΔCt/0.015625；将数值代入hPVT1与uc002mbe.2结合的诊断模型，公式为：logitp＝-1.5221+0.0363×valuehPVT1+0.1749×valueuc002mbe.2；求出概率p=11+exp[-(-1.5221+0.0363×valuehPVT1+0.1749×valueuc002mbe.2)];]]>以概率p＝0.5745为诊断阈值，高于0.5745则诊断为肝癌，低于0.5745则诊断为非肝癌。由此，所述的诊断组合可应用于肝癌预警。本专利技术另一目的是提供含有所述血清lncRNAhPVT1和uc002mbe.2组成的肝癌诊断组合的试剂盒，所述试剂盒包含用于检测血清lncRNA组合在血清中表达水平的试剂，包括分别用于检测hPVT1和uc002mbe.2的引物系统；所述试剂盒还包括血清RNA提取系统、反转录系统、实时荧光定量PCR系统、内源参照GAPDH检测系统相关试剂，为本领域中常规试剂。不仅如此，专利技术人发现本专利技术肝癌诊断组合与传统的肝癌筛查手段——AFP，有互补的作用，二者结合将大大提高诊断效力(见表二、图3)。通过内源参照本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种肝癌诊断组合，包括血清lncRNA hPVT1和uc002mbe.2。

【技术特征摘要】
1.一种肝癌诊断组合，包括血清lncRNAhPVT1和uc002mbe.2。
2.一种用于肝癌诊断的诊断试剂盒，其特征是，包含用于检测权利要求1所述组合在血
清中表达水平的试剂。
3.如权利要求2所述用于肝癌诊断的诊断试剂盒，其特征是，所述试剂盒包括分别用于
检测hPVT1和uc002mbe.2的引物系统。
4.如权利要求3所述用于肝癌诊断的诊断试剂盒，其特征是，所述试剂盒还包括血清
RNA提取系统、反转录系统、实时荧光定量PCR系统、内源参照GAPDH检测系统相关试剂。
5.一种肝癌诊断组合...

【专利技术属性】
技术研发人员：王传玺，秦成勇，于金玉，
申请(专利权)人：山东省立医院，
类型：发明
国别省市：山东;37