本发明专利技术涉及一种用于儿科的肺吸虫病诊断的试剂盒，所述试剂盒包含的适配子能够高效的特异性的结合ESP。该适体的获得是应用新的组合化学技术SELEX，以ESP为靶目标，从随机文库中筛选出了能与ESP特异性结合的RNA适配子。通过适配子特异性的结合ESP，从而定量测定血液中的肺吸虫病，从而能够快速高效的初步筛选肺吸虫病。该试剂盒制备简单，成本低廉，适宜于大面积的推广使用，具有极高的社会价值。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及医学检测领域，特别涉及一种用于儿科的肺吸虫病诊断用的试剂盒。
技术介绍
儿童由于体内免疫能力较低，经常罹患各种疾病，特别是寄生虫类的疾病。肺吸虫病(Paragonimiasis)是一种常见和重要的人兽共患寄生虫病，主要流行于亚洲、非洲和拉丁美洲，尤以亚洲地区多见，在我国流行于22个省、市、自治区，估计每年感染者约200万之多，严重危害人类健康，尤其是青少年、儿童的健康。肺吸虫病主要是肺吸虫虫体(幼虫或成虫)在人体组织与器官内移行、寄居造成的机械性损伤，及其代谢物等引起的免疫病理反应。小儿肺吸虫病临床表现：依肺吸虫寄生的部位而分为以下几型。1.肺型起病大多缓慢，全身症状有发热、乏力、消瘦、盗汗等。同时咳嗽、胸闷、胸痛、咯铁锈色痰或痰带血丝。有时可伴有胸腔积液。2.脑型多见于儿童。表现为头痛、呕吐、意识障碍、癫发作和瘫痪等。因病变在脑中主要损害的部位而分为癫型、脑瘤型、脑膜炎型、脑血栓型和癔病型。脑脊液常有异常改变。3.腹型主要为腹痛、腹壁紧张、局部有压痛。如虫囊侵及肠壁时可有腹泻及粘液脓血便。4.皮下结节大小不等(约0.5～4cm直径大小)，位于深部皮下，以腹壁皮肤多见，能向各处迁移游走。在我国，致病虫种主要为卫氏肺吸虫和斯氏肺吸虫或斯氏狸殖吸虫，其成虫寄生于人、犬、果子狸等肉食动物的肌肉和器官如肝、肺中；尤其斯氏肺吸虫作为仅在我国流行的一种吸虫，其在人体内不能发育成熟，而以幼虫在人体内移行、窜扰，常常引起游走性皮下包块或结节，脑占位性病变和内脏损伤等肺外型寄生虫表现，造成多器官、组织的损害。肺吸虫病根据肺吸虫寄生部位不同，出现复杂的病理变化和多种多样的临床表现，临床症状不典型，易与其他疾病混淆，误诊率极高。对于感染早期、低度感染及肺外型肺吸虫病患者，以发现虫卵或虫体的病原学检测方法往往难以获得检测结果。半胱氨酸蛋白酶(Cysteine protease)是多种寄生虫分泌、排泄的一种蛋白水解酶，也是免疫优势抗原，并具有明显的种、属特异性。专利技术人研究发现，斯氏狸殖吸虫的半胱氨酸蛋白酶对宿主具有免疫原性和反应性，能诱导免疫反应，可作为肺吸虫病的免疫诊断抗原；因该蛋白酶的免疫组化反应呈现虫体的肠道、排泄囊内，其编码基因杂交定位在成虫的肠壁、体壁，故将该蛋白酶又称为肺吸虫排泄分泌蛋白(Excretory-secretory protein,ESP)。已有研究证实，通过检测ESP蛋白的存在与否，即可检验肺吸虫病的存在。目前，用于肺吸虫病的免疫学检测方法种类较多，包括抗体检测方法如皮内试验(IT)、补体结合试验(CFT)、间接血凝试验(IHA)、对照免疫电泳试验(CIEP)、免疫荧光试验(IFAT)、酶联免疫吸附试验(ELISA)等；以及抗原检测方法如多克隆或单克隆抗体ELISA法等。抗体检测方法敏感性高，但因治愈后抗体在体内仍可维持较长时间，致使疗效考核效果不理想，尤其在疫区反复感染人群中无法区别是现行感染还是既往感染；抗体检测中使用的抗原，如虫体抗原、排泄分泌抗原等，均为粗抗原，易出现同源吸虫间交叉反应，并严重依赖于虫体来源的成分；各实验室的检测抗原不一致，导致无法对检测结果进行比较等问题。此外，循环抗原(CAg)检测，即对虫体的代谢产物及腺体分泌液、子宫液、脱落的虫体皮层表膜等抗原性物质的检测，方法特异性高，能反映感染虫荷；因CAg出现较抗体产生为早，有早期检测价值；而且经有效治疗使虫体死亡后抗原消失快，可用于确诊和(或)疗效考核，但其不足之处在于敏感性较低，并受多种因素干扰。这一现状严重影响了临床上肺吸虫感染的早检测、早预防、早治疗，限制了人肺吸虫感染的流行病学调查研究。虽然可以采用抗体通过酶联免疫反应来定量分析ESP的含量，但是该方法对抗体的要求比较高，并且检测成本也比较高，因此，对于贫穷落后地区，并不适宜大面积推广。SELEX技术是20世纪90年代初发展起来的一种新的组合化学技术。利用该技术可以从随机单链寡核苷酸库中筛选到特异性与靶物质高度亲和的核酸适配体。其基本思路是体外化学合成一个单链寡核苷酸库，与靶物质混合，形成靶物质-核酸复合物，洗脱未结合的核酸，分离与靶物质结合的核酸分子，并以此核酸分子为模板进行PCR扩增，再进入下轮的筛选。通过重复的筛选与扩增，一些与靶物质不结合或与靶物质有低亲和力、中亲和力的核酸分子被洗去，而与革G物质有强亲和力的核酸分子从非常大的随机库中分尚出来，且纯度随SELEX过程的进行而增高，最后占据库的大多数(>90％左右)。自Tuerk和Ellington等首先运用此技术筛选到特异性吸附噬菌体T4DNA聚合酶和有机染料分子的特异核酸适配体后，经过十几年的发展，SELEX技术已经成为一种重要的研宄手段和工具。因此，采用selex技术，筛选特定的结合ESP的适配体，进而将适配体制备成为特异性检测ESP的试剂盒，准确、快速、简便地进行肺吸虫病的诊断与鉴别诊断、以及疗效考核具有重要意义及广阔的应用前景。
技术实现思路
本专利技术的技术方案通过以下步骤实现：本专利技术的目的是提供一种ESP的核酸适配体序列。本专利技术中，所述的ESP的核酸适配体(序列1-16)能够特异结合ESP。本专利技术的进一步的目的是提供所述核酸适配体序列的用途。本专利技术中根据对该序列应用，可进一步用于制备特异性结合ESP的试剂盒。从体外合成的随机寡聚DNA文库，(5′-AACATGAGCAACATTAGCCA----N36----GGACAGTGAACGAAGTACCT-3′)，其中N36为36个随机寡核苷酸；从中筛选出与ESP特异结合的核酸适配体；将筛选出的序列用引物P1：AACATGAGCAACATTAGCCA；引物P2：AGGTACTTCGTTCACTGTCC，进行扩增并进行TA克隆入pMD19-T载体(购自上海博光生物公司)，转化DH5a细菌(购自北京天根生物公司)；挑去白色菌落进行PCR确定阳性克隆后，抽提质粒并测序反应，上测序仪测序。本专利技术采用核酸适配体的体外筛选(SELEX)技术，以ESP为正筛靶标，筛选与ESP特异结合的核酸适配体，制得具有特异结合ESP的序列，本专利技术中命名为适配体ESP ap-1～16。序列如下：ESP ap-1:AACAUGAGCAACAUUAGCCAUUAAUACAAAUCUCUAAAUAGAACCACCCCAACUUUGGACAGUGAACGAAGUACCUESP ap-2:AACAUGAGCAACAUUAGCCAAUAUACCUUACCCUAUCCAAGACAAUCUAUCUCCCAGGACAGUGAACGAAGUACCUESP ap-3:AACAUGAGCAACAUUAGCCACUAUACUUAAUUUCACAACAGAAUCUAACCUCCUAAGGACAGUGAACGAAGUACCUESP ap-4:AACAUGAGCAACAUUAGCCAAAUUACCCCCUCUUCAGAACACAAUCUAUAAAAUCAGGACAGUGAACGAAGUACCUESP ap-5:AACAUGAGCAACAUUAGCCAUCUUUAUUUAUUCAUCCGCUCUUACUCCAAUCACUAGGACAGUGAACGAAGUACCUESP ap-6:AACAUGAGCAA本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种用于特异性诊断肺吸虫病的试剂盒，其含有核酸适体。
【技术特征摘要】
1.一种用于特异性诊断肺吸虫病的试剂盒，其含有核酸适体。2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述适体为SEQ ID No.1-16任一条序列所示，或者在该序列的基础上进行的一个或几个核苷酸的替换，并...
【专利技术属性】
技术研发人员：陈博，
申请(专利权)人：陈博，
类型：发明
国别省市：江西;36
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