一种利用单细胞测序检测微量真菌的方法及试剂盒技术

本发明专利技术涉及微生物及分子生物学领域，尤其涉及一种利用单细胞测序检测微量真菌的方法及利用该方法制成的真菌检测试剂盒。本发明专利技术方法包括微量真菌细胞的获取、真菌细胞壁破壁提取真菌原生质、微量真菌原生质gDNA的提取和扩增、微量gDNA建库、基因组测序、生物信息学分析比对、判定所检测真菌的种类等步骤。本发明专利技术方法实现了对微量真菌的高效检测，可以直接应用于微量、疑难真菌样本或混合样本的分离、检测、鉴别及遗传信息的深入研究。本发明专利技术真菌检测方法及试剂盒适用于工业生产、环境监测、空气检测、土壤检测、水质检测、食品检测、药品检测、化妆品检测、保健品检测以及医学检测等领域。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及微生物及分子生物学领域，尤其涉及一种利用单细胞测序检测微量真菌的方法及利用该方法制成的真菌检测试剂盒。
技术介绍
1.现有单细胞测序技术概述1)目前单细胞测序技术主要用于人或哺乳动物胚胎细胞、干细胞发育研究，此类细胞只有细胞膜，没有细胞壁，因而无需破壁，从微量细胞中提取gDNA比较容易。2)有报道单细胞测序技术用于植物种子发育、植物内生真菌的细胞测序研究，此类细胞可以被分离培养，所以比较容易获得纯细胞系进行分子检测实验。2.现有的真菌破壁、DNA提取技术概述1)物理方法：于研钵中加液氮研磨、研磨仪低温研磨，但此法需要大量的菌体，不能应用于微量样本。2)化学方法：氯化苄提取法等，易降解，所提取的DNA完整性差，一般只够做PCR，难以达到用于基因组建文库的完整性要求。3)酶法：蜗牛酶、纤维素酶、溶菌酶、溶壁酶等，效率低，所提取的DNA不够微量样本进行建库的量。3.现有对微量真菌样本的检测技术概述1)镜检：直接在显微镜下观察，虽然简便、快速，但灵敏度低，需要丰富经验，极易漏检。2)培养：培养过程中真菌的形态和生化指标可作为检测的重要标准，但耗时长、易污染、很多真菌(尤其是病原真菌)难以在人工培养条件下培养成功。3)PCR及基因芯片技术：适用于有明确范围的真菌检测，需要有针对性的设计引物、探针，不适用于完全未知的物种。4)使用通用引物进行PCR扩增后进行一代测序：适用于单一的未知真菌检测，一般用于可培养的纯菌检测，不适用于复杂样本的一次性检测。5)应用新一代宏基因组测序：可用于复杂样本的检测，但由于真菌的DNA与其他微生物或哺乳动物相比难以提取，所以会产生大量与目的菌种无关的数据，数据的甄别难度很大。根据以上对现有技术的概述可以看出，目前针对微量真菌的检测技术主要存在以下技术缺点：1.难以对微量、不可培养或培养难度大的真菌进行高效破壁。2.难以对微量真菌提取足量的可进行基因组建库的gDNA。3.难以对复杂样本中特定的真菌进行检测。总而言之，真菌破壁提取完整基因组DNA一直是本领域中的难题，尤其是微量真菌样本，如何在微量的复杂样本中，提取可以达到二代测序建文库所需的真菌gDNA，并对其进行全基因组测序是目前还未有人报道的。本专利技术方法通过取真菌微量细胞进行破壁，提取、扩增gDNA，并进行新一代测序的文库建立、基因组测序分析等步骤，可以很好的克服上述技术缺陷，从而实现对微量真菌的高效检测，本专利技术方法可以直接应用于微量、疑难真菌样本或混合样本的分离、检测、鉴别及遗传信息的深入研究。根据本专利技术方法制成的真菌检测试剂盒可广泛应用于工业生产、环境监测、空气检测、土壤检测、水质检测、食品检测、药品检测、化妆品检测、保健品检测以及医学检测等多种领域。本专利技术技术的推广应用将会具有良好的市场前景并产生可观的经济及社会效益。
技术实现思路
解决的技术问题本专利技术需要解决的问题是：本专利技术的目的是克服现有微量真菌检测技术所存在的不足，如难以对微量、不可培养或培养难度大的真菌进行高效破壁；难以对微量真菌提取足量的可进行基因组建库的gDNA；难以对复杂样本中特定的真菌进行检测等问题。技术方案本专利技术旨在建立一套完整的微量真菌检测技术方案，以解决目前存在的难以分离培养、难以用常规方法对复杂样本中的微量真菌进行分子检测和遗传信息研究的技术难题。本专利技术方法通过复杂样本中单个真菌细胞的分离获取和对其原生质的提取，尤其是对该真菌细胞壁的高效破除，以及对上述真菌原生质进行gDNA提取、扩增和建库，并与新一代测序技术结合分析基因组信息，而不是传统的PCR或基因芯片层次的单个或多个特定序列的测定和分析，最终实现对该真菌的准确检测。首先，本专利技术提供了一种利用单细胞测序检测微量真菌的方法，包括以下步骤：(1)微量真菌细胞的获取：将微量真菌样本涂于激光显微切割覆膜载玻片上，用激光显微切割系统找到目的细胞，用激光强度37-43微焦对所选出的单个真菌细胞进行激光显微切割，获得单个目的细胞，重复上述操作获取总数为1-100个的目的细胞；(2)真菌细胞壁破壁：化学法与混合酶法结合提取真菌原生质；1)将0.8M D-山梨醇溶液加入到装有上述目的细胞的离心管中，在4℃条件下浸泡目的细胞2小时；2)配制复合预处理剂：将50mM Tris，5mM EDTA，5％β-巯基乙醇混合均匀；3)配制混合酶处理剂：将蜗牛酶1-10mg/mL，溶壁酶1-10mg/mL，溶菌酶1-10mg/mL，纤维素酶1-10mg/mL四种酶中的至少两种酶按一定比例混合，当所述混合酶处理剂仅由两种酶混合组成时，其中至少包括蜗牛酶和溶壁酶中的一种；4)将上述复合预处理剂加入装有目的细胞的离心管中，35℃处理细胞1小时；5)上述离心管经离心后将细胞收集至管底，弃去处理剂；6)向上述离心管中加入无菌水洗涤细胞两次，离心，弃去液体；7)向上述离心管中加入混合酶处理剂，35-45℃处理3-12小时；8)上述离心管经离心后将细胞收集至管底，弃去液体；9)向上述离心管中加入PBS洗涤细胞一次，离心，弃去液体，保留4-10μl细胞悬液；(3)微量真菌原生质gDNA的提取和扩增：利用单细胞全基因组扩增试剂盒对上述步骤中获得的4-10μl细胞悬液进行核酸提取及扩增反应，获得上述真菌gDNA；(4)微量gDNA建库：利用DNA建库试剂盒对上述真菌gDNA进行建库；(5)基因组测序：对上述建库的真菌gDNA进行全基因组测序；(6)生物信息学分析：利用相关软件对测序获得的数据进行组装，得到组装结果与相关公开数据库进行比对，判定所检测真菌的种类。进一步地，本专利技术方法可检测的真菌包括念珠菌属中的白色念珠菌、光滑念珠菌、克柔念珠菌、热带念珠菌、近平滑念珠菌、都柏林念珠菌；曲霉属中的烟曲霉、黄曲霉、土曲霉、构巢曲霉、黑曲霉、焦曲霉；隐球菌属中的新生隐球菌、格特隐球菌以及上述各菌种的变种；上述各菌种及其变种均属于临床医学中的致病菌，虽然是可被体外培养的，但由于患者用药等因素，在真实临床样本中难以被分离培养成功。进一步地，本专利技术方法可检测的真菌还包括马拉色菌，该菌种属于苛养的真菌，对培养条件要求苛刻，需要在培养基中补充特殊营养成分才能够培养成功。进一步地，本专利技术方法可检测的真菌还包括组织胞浆菌、伊蒙菌、申克氏孢子丝菌、马
尔尼菲青霉、巴西副球孢子菌、皮炎芽生菌、粗球孢子菌；上述菌种在体外难以培养成功。作为一种优选方案，本专利技术方法中的第(2)步骤真菌细胞壁破壁：化学法与混合酶法结合提取真菌原生质，其中配制的混合酶处理剂为蜗牛酶6mg/mL和溶壁酶4mg/mL；向离心管中加入混合酶处理剂后，37℃处理6小时；最终保留4μl细胞悬液。作为另一种优选方案，本专利技术方法中的第(2)步骤真菌细胞壁破壁：化学法与混合酶法结合提取真菌原生质，其中配制的混合酶处理剂为蜗牛酶6mg/mL和溶菌酶4mg/mL；向离心管中加入混合酶处理剂后，45℃处理10小时；最终保留5μl细胞悬液。作为另一种优选方案，本专利技术方法中的第(2)步骤真菌细胞壁破壁：化学法与混合酶法结合提取真菌原生质，其中配制的混合酶处理剂为蜗牛酶4mg/mL、溶壁酶4mg/mL和溶菌酶4mg/mL；向离心管中加入混合酶处理剂后，35℃处理8小时；最终保留本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种利用单细胞测序检测微量真菌的方法，包括以下步骤：(1)微量真菌细胞的获取：将微量真菌样本涂于激光显微切割覆膜载玻片上，用激光显微切割系统找到目的细胞，用激光强度37‑43微焦对所选出的单个真菌细胞进行激光显微切割，获得单个目的细胞，重复上述操作获取总数为1‑100个的目的细胞；(2)真菌细胞壁破壁：化学法与混合酶法结合提取真菌原生质；1)将0.8M D‑山梨醇溶液加入到装有上述目的细胞的离心管中，在4℃条件下浸泡目的细胞2小时；2)配制复合预处理剂：将50mM Tris，5mM EDTA，5％β‑巯基乙醇混合均匀；3)配制混合酶处理剂：将蜗牛酶1‑10mg/mL，溶壁酶1‑10mg/mL，溶菌酶1‑10mg/mL，纤维素酶1‑10mg/mL四种酶中的至少两种酶按一定比例混合，当所述混合酶处理剂仅由两种酶混合组成时，其中至少包括蜗牛酶和溶壁酶中的一种；4)将上述复合预处理剂加入装有目的细胞的离心管中，35℃处理细胞1小时；5)上述离心管经离心后将细胞收集至管底，弃去处理剂；6)向上述离心管中加入无菌水洗涤细胞两次，离心，弃去液体；7)向上述离心管中加入混合酶处理剂，35‑45℃处理3‑12小时；8)上述离心管经离心后将细胞收集至管底，弃去液体；9)向上述离心管中加入PBS洗涤细胞一次，离心，弃去液体，保留4‑10μl细胞悬液；(3)微量真菌原生质gDNA的提取和扩增：利用单细胞全基因组扩增试剂盒对上述步骤中获得的4‑10μl细胞悬液进行核酸提取及扩增反应，获得上述真菌gDNA；(4)微量gDNA建库：利用DNA建库试剂盒对上述真菌gDNA进行建库；(5)基因组测序：对上述建库的真菌gDNA进行全基因组测序；(6)生物信息学分析：利用相关软件对测序获得的数据进行组装，得到组装结果与相关公开数据库进行比对，判定所检测真菌的种类。...

【技术特征摘要】
1.一种利用单细胞测序检测微量真菌的方法，包括以下步骤：(1)微量真菌细胞的获取：将微量真菌样本涂于激光显微切割覆膜载玻片上，用激光显微切割系统找到目的细胞，用激光强度37-43微焦对所选出的单个真菌细胞进行激光显微切割，获得单个目的细胞，重复上述操作获取总数为1-100个的目的细胞；(2)真菌细胞壁破壁：化学法与混合酶法结合提取真菌原生质；1)将0.8M D-山梨醇溶液加入到装有上述目的细胞的离心管中，在4℃条件下浸泡目的细胞2小时；2)配制复合预处理剂：将50mM Tris，5mM EDTA，5％β-巯基乙醇混合均匀；3)配制混合酶处理剂：将蜗牛酶1-10mg/mL，溶壁酶1-10mg/mL，溶菌酶1-10mg/mL，纤维素酶1-10mg/mL四种酶中的至少两种酶按一定比例混合，当所述混合酶处理剂仅由两种酶混合组成时，其中至少包括蜗牛酶和溶壁酶中的一种；4)将上述复合预处理剂加入装有目的细胞的离心管中，35℃处理细胞1小时；5)上述离心管经离心后将细胞收集至管底，弃去处理剂；6)向上述离心管中加入无菌水洗涤细胞两次，离心，弃去液体；7)向上述离心管中加入混合酶处理剂，35-45℃处理3-12小时；8)上述离心管经离心后将细胞收集至管底，弃去液体；9)向上述离心管中加入PBS洗涤细胞一次，离心，弃去液体，保留4-10μl细胞悬液；(3)微量真菌原生质gDNA的提取和扩增：利用单细胞全基因组扩增试剂盒对上述步骤中获得的4-10μl细胞悬液进行核酸提取及扩增反应，获得上述真菌gDNA；(4)微量gDNA建库：利用DNA建库试剂盒对上述真菌gDNA进行建库；(5)基因组测序：对上述建库的真菌gDNA进行全基因组测序；(6)生物信息学分析：利用相关软件对测序获得的数据进行组装，得到组装结果与相关公开数据库进行比对，判定所检测真菌的种类。2.如权利要求1所述利用单细胞测序检测微量真菌的方法，其特征在于：所述真菌包括念珠菌属中的白色念珠菌、光滑念珠菌、克柔念珠菌、热带念珠菌、近平滑念珠菌、都柏林念珠菌；曲霉属中的烟曲霉、黄曲霉、土曲霉、构巢曲霉、黑曲霉、焦曲霉；隐球菌属中的新生隐球菌、格特隐球菌以及上述各菌种的变种。3.如权利要求1所述利用单细胞测序检测微量真菌的方法，其特征在于：所述真菌包括马拉色菌。4.如权利要求1所述利用单细胞测序检测微量真菌的方法，其特征在于：所述真菌包括
\t组织胞浆菌、伊蒙菌、申克氏孢子丝菌、马尔尼菲青霉、巴西副球孢子菌、皮炎芽生菌、粗球孢子菌。5.如权利要求1-4中任一项所述的利用单细胞测序检测微量真菌的方法，其特征在于：其中的第(2)步骤如下：(2)真菌细胞壁破壁：化学法与混合酶法结合提取真菌原生质；1)将0.8M D-山梨醇溶液加入到装有上述目的细胞的离心管中，在4℃条件下浸泡目的细胞2小时；2)配制复合预处理剂：将50mM Tris，5mM EDTA，5％β-巯基乙醇混合均匀；3)配制混合酶处理剂：蜗牛酶6mg/mL，溶壁酶4mg/mL；4)将上述复合预处理剂...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨英，王升启，周喆，王澎，李珍，李宗玮，
申请(专利权)人：中国人民解放军军事医学科学院放射与辐射医学研究所，
类型：发明
国别省市：北京;11