本发明专利技术提供了一种同时对单细胞基因组和转录组进行高通量文库构建及测序的方法。本发明专利技术还提供了一种基于单细胞整合基因组学(SCIG)的测序方法及其应用。本发明专利技术提供的SCIG方案能够实现在单次实验中同时得到一个单细胞的基因组和转录组，获得单个细胞中遗传和表观遗传信息，并进行综合分析，全方位，多层面的展示该细胞的状态；这些优势使得SCIG在鉴定单细胞的特性和共性方面具有优越性。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及高通量测序领域，具体涉及一种同时对单细胞基因组和转录组构库及 测序的方法，基于单细胞整合基因组学（SCIG)的测序方法及应用。
技术介绍
单细胞DNA全基因组测序和RNA转录组测序技术在近年来发展迅速。单细胞DNA 扩增方法，在最初的Multipledisplacementamplification(MDA)方法基础上，又陆续产 生了GenomePlex(WGA4)方法和MultipleAnnealingandLoopingBasedAmplification Cycles(MALBAC)方法。单细胞mRNA扩增方面也陆续产生了SMART-Seq，CEL-Seq， Quartz-Seq等新技术，极大提高了微量mRNA的扩增效率。目前所有有关单细胞技术方面的研究成果尚不完善，具体分成两类：a只测基因 组，不测转录组；b只测转录组，不测基因组；然而，这些分析方法无法展示单细胞的全貌。 如何实现在单次实验中同时得到一个单细胞的基因组和转录组，获得单个细胞中遗传和表 观遗传信息，并进行综合分析，全方位，多层面的展示该细胞的状态，仍是行业难点。
技术实现思路
为解决上述问题，本专利技术提供了一种同时对单细胞基因组和转录组构库及测序的 方法，基于单细胞整合基因组学（SCIG)的测序方法及应用。 本专利技术提供的"单细胞整合基因组学（SingleCellIntegratedGenomics,SCIG) 方法"是指，通过对单个细胞的核质分离，对细胞核和细胞质分别进行单细胞全基因组扩增 和转录组扩增，用高通量测序和生物信息学分析。 进一步地，其中的生物信息分析方法，包括：将单个细胞的基因组和转录组数据整 合，综合考虑，分别开展聚类分析，相关性分析和进化树分析，准确鉴定细胞（比如单个肿 瘤）中的多个亚克隆，结合细胞（比如癌细胞）的基因型和表型特征之间的一一对应关系 的分析模型，更准确地鉴定组织内部（尤其是肿瘤内部）的多个不同的细胞克隆。 本专利技术生物信息分析方法，还包括但不限于：等位基因分析、基因表达分析、RNA 编辑分析，比较基因组和转录本之间的关联分析，如某原癌基因调控区域小片段的缺失导 致基因表达的不正常上升，引发疾病，或者该基因表达区域一个碱基突变，导致所表达的蛋 白失活等等。本专利技术提供的技术方案可以做到个体样本点对点的相关性分析，而非传统的 通过群体相关来推断。 第一方面，本专利技术提供了一种同时构建单细胞基因组和转录组高通量测序文库的 方法，包括如下步骤：a)获取单细胞； b)分离细胞核和细胞质； c)单个细胞核全基因组扩增，获得基因组测序文库； d)单个细胞去核细胞质全转录组扩增，获得转录组测序文库。 优选地，所述步骤a)中，所述单细胞为卵母细胞、肿瘤细胞、神经细胞或癌细胞。 优选地，所述步骤b)中，采用显微注射（Microinjection)法对单个细胞进行核质 分呙。 进一步优选地，所述显微注射法中，微细管针（microcapillaryneedle)的直径在 0· 5-5 微米（microns)，抓针（holdingneedle)的直径在 10-50 微米（microns)。 在本专利技术实施例中，分别以卵母细胞和癌细胞为例进行了实验。其中，卵母细胞胞 体较大（100微米左右直径），核相对较小，采用显微操作，抽核效果比较好；但是肿瘤细胞 胞体比较小（25微米左右直径），核则相对于细胞体比较大，如果用抽核的方法，很难成功， 本专利技术反过来通过抽取细胞质的方法或者采用完全不同的方法，通过裂解细胞膜但保持细 胞核膜完整，释放细胞质，收集RNA，然后分别进行细胞质和细胞核的分析。 优选地，所述步骤c)中，采用WGA4或MDA进行全基因组扩增。 优选地，所述步骤d)中，采用Smart_seq2进行全转录组扩增。 本专利技术提供的同时构建单细胞基因组和转录组高通量测序文库的方法，先对单个 细胞的分选，对单细胞进行核质分离，对两种组分分别进行基因组和转录组的扩增、测序文 库的构建和质检、二代深度测序等步骤获得完整的单细胞序列文库。 第二方面，本专利技术提供了 一种同时对单细胞基因组和转录组进行高通量测序的方 法，包括如下步骤：对第一方面所得的基因组测序文库和转录组测序文库进行高通量测序， 分别获得单细胞的基因组序列信息和转录组序列信息。 优选地，对第一方面所得的基因组测序文库进行外显子组高通量测序。 第三方面，本专利技术提供了一种基于单细胞整合基因组学的测序方法，包括如下步 骤：对第二方面所得的单细胞的基因组序列信息和转录组序列信息进行生物信息学分析。 第四方面，本专利技术提供了一种基于单细胞整合基因组学的方法鉴定细胞亚克隆的 方法，包括如下步骤：根据多个第三方面所得的生物信息学分析序列信息，鉴定细胞亚克 隆。 优选地，所述生物信息学分析的方法包括：将单个细胞的基因组和转录组数据整 合，分别开展聚类分析，相关性分析和进化树分析，准确鉴定细胞（优选为单个肿瘤）中的 多个亚克隆。 进一步优选地，所述生物信息学分析的方法还包括：结合细胞（优选为癌细胞）的 基因型和表型特征之间的一一对应关系的分析模型，更准确地鉴定组织内部（优选为肿瘤 内部）的多个不同的细胞克隆。 如本专利技术所述的，所述的"聚类分析"、"相关性分析"和"进化树分析"包括但不限 于行业内相应的常规分析方法。 优选地，所述细胞亚克隆为肿瘤细胞亚克隆或癌细胞亚克隆。 第五方面，本专利技术提供了如第三方面所述的基于单细胞整合基因组学的测序方法 在等位基因检测中的应用。 优选地，所述等位基因检测为检测杂合子数量和/或纯合子数量。 第六方面，本专利技术提供了如第三方面所述的基于单细胞整合基因组学的测序方法 在基因表达检测中的应用。 优选地，所述的基因表达检测包括检测mRNA和IncRNA中的至少一种。 优选地，所述的基因表达检测为检测小鼠卵母细胞的基因表达，且检测量不低于 13, 000 (优选为13,686)条蛋白编码基因的表达和/或不低于500 (优选为521)条IncRNA 基因的表达。 第七方面，本专利技术提供了如第三方面所述的基于单细胞整合基因组学的测序方法 在单等位基因（monoallelic)表达检测中的应用。 优选地，所述的单等位基因（monoallelic)表达检测为检测杂合子的单等位基因 (monoallelic)表达数量。 第八方面，本专利技术提供了如第三方面所述的基于单细胞整合基因组学的测序方法 在RNA编辑位点（RNAeditingsites，RESs)检测中的应用。 优选地，所述的RESs检测包括但不限于：A-to-G、A-to-C、A-to-T、T-to-C、 T_to_G、T_to_A、C_to_T、C_to_A、C_to_G、G_to_A、G_to_T、G_to_C、插入突变（ins)及缺失 突变（del)中的一种或多种。 优选地，所述的RESs检测为检测小鼠卵母细胞的RESs，且A-to-G和T-to-C类型 的检出值占所有检出RESs位点总量不低于20% (优选为30% -38% )。 第九方面，本专利技术提供了如第一方面所述的同时构建单细胞基因组和转录组高通 量测序文库的方法、或如第三方面所述的基于单细胞整合基因组学的测序方法在二代、下 一代或单本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种同时构建单细胞基因组和转录组高通量测序文库的方法，其特征在于，包括如下步骤：a)获取单细胞；b)分离细胞核和细胞质；c)单个细胞核全基因组扩增，获得基因组测序文库；d)单个细胞去核细胞质全转录组扩增，获得转录组测序文库。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：李周芳，贺建奎，王嫣，郭佳杰，张萌，
申请(专利权)人：南方科技大学，
类型：发明
国别省市：广东;44
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