一种单细胞全基因组扩增方法技术

本发明专利技术公开了一种单细胞全基因组扩增方法，包括如下步骤：(1)分离、获得单个细胞样本；(2)单细胞样本全基因组DNA扩增；(3)对扩增产物进行定量和定性分析；(4)建立基因组测序文库及测序并进行基因组生物信息分析。本发明专利技术建立了一种单细胞基因组DNA扩增方法流程，利用本发明专利技术可以检测整个染色体的单体、三体、多体和性染色体缺失、少数碱基的插入和缺失、DNA拷贝数变异、单核苷酸多态性位点等单细胞基因组的遗传变异信息。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术设及一种基于非指数扩增及高通量测序的单细胞基因组分析方法，通过该 方法在单细胞水平上对基因组进行分析。
技术介绍
随着基因组学研究的不断发展，越来越多的研究者开始不再局限于多细胞水平的 基因研究，而是将目光聚焦在更具体的单个细胞的水平。单细胞是多细胞生物的基本单元， 多细胞生物的发育从单细胞开始，在严格的时间和空间序列中不断分裂，但是运样的复杂 过程只能在单细胞水平才能真正理解。另外，多细胞生物体内每个细胞都处于独特的微环 境中，没有两个完全一样的细胞，特别是肿瘤组织中，高度异质性的存在使得从单细胞的角 度进行研究成为必须。另一方面，有些样品稀少无法在实验室培养，样品量不足W进行全基 因组分析，例如肿瘤循环细胞、组织微阵列、早期发育的胚胎细胞等。 在很长一段时间，单细胞样本的获得及核酸含量的有限性使得单细胞基因组分析 成为难题。而近年来，流式细胞分选和激光捕获显微切割技术的出现W及单细胞全基因组 扩增技术的不断改进，让大量单细胞的捕获和检测成为可能。单细胞测序技术正逐渐从实 验研究方法成为指导临床的有利工具，也逐渐发展出很多的临床应用。 结合单细胞分选技术，通过全基因组扩增技术和高通量分析技术，单细胞的全基 因组分析已经成为可能，并已有一些应用的实例。全基因组扩增技术可对非常微量的DNA 进行扩增获得大量DNA，故被认为是目前解决运一难题的一种基本方法，已被广泛用于法医 学、单基因遗传病的诊断及疾病基因的分析等领域研究，并取得了良好的效果。但同时该技 术也存在一些局限性，由于全基因组扩增的起始反应产物极少，甚至只有一个DNA分子，运 样在扩增反应时就难免出现不均一的问题，即可能在基因组中某些位点会扩增多次，而另 外一些位点则无法扩增，运样可能会使结果分析产生偏差。因此很多科研机构也正在致力 于全基因组扩增技术的不断改进，目前已有的一些扩增技术主要是基于多重PCR及等溫链 置换技术，如D0P-PCR、MDA等，但仍然存在扩增偏差大、扩增产物量低的问题。本专利技术建立 了一种新型的基于环状循环扩增技术的单细胞扩增方法，并构建了一套基于该方法的单细 胞测序流程，该扩增技术经过高通量测序验证，其数据的重复性、均一性和覆盖度均优于传 统技术，经过测序数据比对分析其覆盖度可达到90 %。
技术实现思路
阳0化]为解决上述技术问题，本专利技术提供了一种单细胞全基因扩增技术，并通过高通量 测序对其比对率、均一性、覆盖度等进行分析，与传统的扩增技术相比，其重复性、均一度均 有所提高。具体
技术实现思路
如下： 1、单细胞样本的分离 可通过显微操作、流式细胞仪、激光显微切割等技术进行单细胞样本的分离，可用 于胚胎细胞、循环血液细胞、组织切片等常见临床样本的细胞分离；[000引 2、扩增引物设计 设计两端序列相同的随机预扩增引物，使得片段两端可W相连成环，避免了某些 区域的偏向性扩增。预扩增引物序列如下： 其中NNN順代表5碱基的随机序列；扩增引物序列为：AGGTAGAGTGGTAGTAGGTGTAAGGAG ; 3、单细胞基因组扩增 阳〇1引 （1)单细胞裂解： 取分离出的单细胞样本，加入1. 5y1含有IM DTT的QiagenDLB溶液，65°C反应 IOmin;加入1. 5的stopsolution,此时反应体系为5Ji1 ; (2)单细胞预扩增实验： 阳01引曰、向单细胞裂解产物中接入25y1的预扩增的MIX，94°C反应3min，反应结束，立 即放在冰上；MIX的反应体系如下表1 : 表 1 b、在冰上加入 1Ji1 的Bstlargefra卵ent，1Ji1 的Py;roF*hage3173DNA Polymeraseexo-，反应条件为：10°Cfor45sec;20°Cfor45sec;30°Cfor45sec; 40°Cfor45sec;50°Cfor45sec;65°Cfor2min;94°Cfor20sec;反应结束立即放在冰上 终止反应； C、在冰上加入 1Ji1 的Bstlargefra卵ent，1Ji1 的Py;roF*hage3173DNA Polymeraseexo-，反应条件为：10°Cfor45sec;20°Cfor45sec;30°Cfor45sec; 40°Cfor45sec;50°Cfor45sec;65°Cfor2min;94°Cfor20sec;58°Cfor20sec;反应 结束立即放在冰上终止反应，运一步循环操作5次； 阳〇2引 做扩增反应 将预扩增产物分成两份，此时预扩增产物有44y1，将预扩增产物分成两份，各 22y1，每份各加入体积如表2 : W巧]表2 反应条件为：94°Cfor20sec;59°Cfor20sec;65°CforImin;72°Cfor2min，共 17个循环； 4、高通量测序分析 用全基因组扩增样本进行高通量文库构建及测序，测序结果与参考基因组进行比 对，分析序列的比对率、重复性、均一度W及覆盖度等。 通过上述技术方案，本专利技术建立了一种新型的基于环状循环扩增技术的单细胞扩 增方法，并构建了一套基于该方法的单细胞测序流程，该扩增技术经过高通量测序验证，其 数据的重复性、均一性和覆盖度均优于传统技术，经过测序数据比对分析其覆盖度可达到 90%。【附图说明】 为了更清楚地说明本专利技术实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使 用的附图作简单地介绍。 图1为本专利技术实施例中单细胞扩增产物琼脂糖凝胶电泳图； 图2为本专利技术实施例中13S体细胞检测结果图； 图3为本专利技术实施例中样本扩增均一性的分析图。【具体实施方式】 下面将结合本专利技术实施例中的附图，对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完 整地描述。 实施例1 : 阳037] 单细胞样本的分离 采用培养的染色体异常的阳性细胞系及正常细胞系，分别挑选单个细胞对实验流 程进行验证，细胞类型如表3所示，用显微操作法对单个细胞进行分离，用口吸管吸取单个 细胞在IXPBS溶液中洗涂3遍，然后转移至0. 2血的PCR管中，体积不超过2y1。 表 3 阳〇4U 实施例2: 单细胞扩增实验 根据
技术实现思路
中所述单细胞扩增流程，对分离出的单细胞样本进行全基因组扩 增；用1. 5X的AmpureXP磁珠对扩增产物进行纯化；纯化后用如bit检测扩增产物浓度， 结果如实施例1中的表3所示，扩增产物浓度均一，重复性好；用2%的琼脂糖凝胶电泳分 析扩增片段长度，结果如图1所示。 W44] 实施例3 : W45] 扩增产物片段化 用NEB的片段化酶切试剂盒对纯化后的产物进行片段化，片段化长度为 150-200bp，37°C处理20min，酶切体系如下表4 : 表 4 酶切产物用1. 8X的AmpureXP磁珠进行纯化。 实施例4 : 文库构建、上机测序及测序结果分析 纯化后的DNA义用Life的IonXpressPlusRra卵entLibraryKit试剂盒进行 文库构建，构建好的文库用如bit2.0巧光计检测浓度，Aglient2100分析片段长度，根据 浓度及片段长度换算分子数，经过稀释后进行乳液PCR，然后上机测序，每个样本约测6M的 原始数据；其中正常核型的单细胞样本测序深度为20X，用于分析单细胞扩本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种单细胞全基因组扩增方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)单细胞样本的分离；(2)扩增引物设计：设计两端序列相同的随机预扩增引物及扩增引物，使得片段两端可以相连成环，避免了某些区域的偏向性扩增；(3)单细胞基因组扩增：①单细胞裂解：基于步骤(1)获得的单细胞样本进行裂解；②单细胞预扩增：向①中单细胞样本裂解后的产物中加入步骤(2)中设计的预扩增引物进行预扩增；③扩增反应：然后向②中预扩增产物中加入步骤(2)中设计的扩增引物进行扩增反应；(4)高通量测序分析：基于步骤(3)中的扩增后的全基因组扩增样本进行高通量文库构建及测序，并将测序结果与参考基因组进行比对分析。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：梁波，孔令印，冒燕，申静静，刘慧敏，孙丹凤，
申请(专利权)人：苏州贝康医疗器械有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32