对细胞基因组的预定位点进行基因改造的方法技术

本发明专利技术公开了重组细胞、用于对细胞进行基因改造的试剂以及对细胞基因组的预定位点进行基因改造的方法，其中该重组细胞过表达：第一核酸分子，所述第一核酸分子编码Cas9蛋白或其衍生物，所述Cas9蛋白的衍生物与所述Cas9蛋白相比，缺失DNA切割活性，但保留靶点识别活性。利用该重组细胞，能够有效地通过将Che-chiRNA，或Che-gRNA以及tracrRNA转入本发明专利技术的重组细胞中，即可容易地执行基因组编辑或基因表达调控，从而有效地实现对细胞基因组的预定位点进行基因改造。

【技术实现步骤摘要】
对细胞基因组的预定位点进行基因改造的方法
本专利技术涉及生物
，更具体的，本专利技术涉及重组细胞、用于对细胞进行基因改造的试剂以及对细胞基因组的预定位点进行基因改造的方法。
技术介绍
CRISPR(ClusteredRegularlyInterspacedShortPalindromicRepeats)/Cas9是近两年被广泛认可的由RNA指导Cas核酸酶对靶向基因进行特定DNA修饰的技术。在该技术中，crRNA(CRISPR-derivedRNA)通过碱基配对与tracrRNA(trans-activatingRNA)结合形成双链RNA，得到tracrRNA/crRNA二元复合体。所得到的tracrRNA/crRNA二元复合体能够指导Cas9蛋白在与crRNA引导序列匹配的靶定位点剪切双链DNA，从而达到对基因组DNA进行修饰的目的。CRISPR/Cas9系统能够对多种物种的基因组特定基因位点进行精确编辑，目前已经成功应用于大、小鼠、人源细胞等基因敲除和敲入的模型制备。Cas9系统进行有效工作需要三种元件，即crRNA(CRISPR-derivedRNA，靶标识别20个或30个碱基)、tracrRNA(trans-activatingRNA)及Cas9蛋白。由于crRNA和tracrRNA可以串联操作，所以三元件系统也可以简化成两元件系统，即chiRNA(由crRNA及tracrRNA串联简并而成，靶标识别20个碱基)、Cas9蛋白。故而目前利用Cas9系统进行基因组编辑及基因表达调控的主流策略共有两种：三元件系统、二元件系统。然而，目前利用Cas9系统进行基因组编辑及基因表达调控的方法仍有待改进。
技术实现思路
需要说明的是，本专利技术是基于专利技术人的下列发现而完成的：现阶段，利用Cas9系统进行基因组编辑及基因表达调控，主要有两种策略：一是外源质粒系统策略；二是体外转录合成chiRNA策略。其中，第一种策略(即外源质粒系统策略)，是将Cas9系统相关的元件组装在外源表达质粒系统中，即为将三元件系统或两元件系统中的元件全部整合在一个外源表达载体上，针对基因组中不同的靶点，每次只需对相应的crRNA或chiRNA部分进行质粒的重组即可，其他部分不用操作，然后将质粒转入相应的实验模型中就可以使其工作。该策略具有以下缺点：1.靶点选择的局限：目前常用的靶向识别位点长度为20个碱基，由于U6启动子后连接的第一个碱基必须为G(鸟嘌呤)，因此限定了该20个碱基的第一个碱基必须为G，这就造成了很强的限制，致使靶点的选择丧失了极大的选择空间；2.单质粒系统：构建好的外源质粒过大，会产生不易转染(尤其对于转染效率本来就很低的细胞尤甚)或转染拷贝数过低的问题，而这是Cas9系统常见的效率低下的主因；3.多质粒系统：如需使Cas9系统起效，就要要求全部元件共转入同一细胞，而共转效率却是此技术策略的瓶颈；4.病毒载体系统：Cas9蛋白过大，为4千多个bp，不易包装，致使病毒的包装成功率过低，难以高效的行使功能；5.针对不同位点：需要多次构建crRNA或chiRNA的载体表达部分，操作不便；6.一次性针对多位点操作：需要多个质粒共同转染，共转效率低，致使针对多靶点的操作效率低下；7.Cas9蛋白表达量不稳定：外源表达的Cas9基因转入每个细胞的拷贝数不同，造成细胞中Cas9蛋白的表达量不稳定、均一，限制了Cas9系统的工作效率；8.针对高、中通量操作，周期长，时间成本、人力成本过高。第二种策略(即体外转录合成chiRNA策略)，是将现有的Cas9二元件系统分离，即分为：体外转录chiRNA和cas9蛋白。体外转录chiRNA是通过质粒构建的方式将靶点序列插入到譬如pT7-gRNA这样的载体上，再用T7或SP6等转录酶在实验室体外环境下制备成chiRNA；Cas9蛋白的表达在这一方案中有多种形式：通过转染实现的外源表达，Cas9mRNA(亦为体外转录)的胚胎注射，通过病毒载体整合到基因组中，将Cas9基因序列定点敲入到基因组中。该策略具有以下缺点：1.体外转录chiRNA靶点选择的局限：目前常用的靶向识别位点长度为20个碱基，由于T7或SP6启动子后连接的第一或前两个碱基必须为G(鸟嘌呤)，因此限定了该20个碱基的第一或前两个碱基必须为G，这就造成了很强的限制，致使靶点的选择丧失了极大的选择空间；2.体外转录chiRNA操作环境要求高、技术要求高，转录制备出的RNA在体外环境中极其不稳定，要极其小心处理以避免环境中无处不在的RNA酶；全流程的操作技术要求也远高于其他分子生物学实验；3.体外转录chiRNA成本高，中间过程多用到RNA相关的试剂盒，而RNA试剂盒往往价格不菲，造成全流程成本不低；4.体外转录chiRNA制备步骤多，周期长，流程复杂：需要订购靶点的Oligo、退火链接、转化、测序鉴定、质粒制备、PCR、PCR产物纯化、转录、转录产物纯化、质量鉴定等诸多步骤；5.Cas9蛋白如需共转染，共转染效率亦是问题。6.针对高、中通量操作，周期长，时间成本、人力成本过高。本专利技术旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本专利技术的一个目的在于提出一种相对于现有技术操作更简便、更加安全稳定、更加高效快速、通量更高，适用于各种通量的，利用改进的Cas9系统对细胞基因组的预定位点进行基因改造的方法。因而，根据本专利技术的一个方面，本专利技术提供了一种重组细胞。根据本专利技术的实施例，所述细胞过表达：第一核酸分子，所述第一核酸分子编码Cas9蛋白或其衍生物，所述Cas9蛋白的衍生物与所述Cas9蛋白相比，缺失DNA切割活性，但保留靶点识别活性。专利技术人惊奇地发现，利用该重组细胞，能够有效地通过将Che-chiRNA，或Che-gRNA以及tracrRNA转入本专利技术的重组细胞中，即可容易地执行基因组编辑或基因表达调控，从而有效地实现对细胞基因组的预定位点进行基因改造。另外，根据本专利技术上述实施例的重组细胞还可以具有如下附加的技术特征：根据本专利技术的实施例，所述第一核酸分子定位于所述细胞基因组中的H3F3A基因中。这是因为，H3F3A位于常染色体，将第一核酸分子定位于H3F3A基因操作方便；H3F3A在任何组织中均有表达，可以保证外源基因的有效表达；而融合表达可以尽可能的避免外源DNA的非同源重组。根据本专利技术的实施例，所述细胞过表达：第二核酸分子，所述第二核酸分子编码tracrRNA。根据本专利技术的实施例，所述第一核酸分子具有如下所示的核苷酸序列：atgccaaagaagaagcggaaggtcggtatccacggagtcccagcagccgacaagaagtacagcatcggcctggacatcggcaccaactctgtgggctgggccgtgatcaccgacgagtacaaggtgcccagcaagaaattcaaggtgctgggcaacaccgaccggcacagcatcaagaagaacctgatcggagccctgctgttcgacagcggcgaaacagccgaggccacccggctgaagagaaccgccagaagaagatacaccagacggaagaaccggatctgctatctgcaagagatcttcagcaa本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种重组细胞，其特征在于，所述细胞过表达：第一核酸分子，所述第一核酸分子编码Cas9蛋白或其衍生物，所述Cas9蛋白的衍生物与所述Cas9蛋白相比，缺失DNA切割活性，但保留靶点识别活性。

【技术特征摘要】
1.一种重组细胞，其特征在于，所述细胞过表达：第一核酸分子，所述第一核酸分子编码Cas9蛋白或其衍生物，所述Cas9蛋白的衍生物与所述Cas9蛋白相比，缺失DNA切割活性，但保留靶点识别活性，其中，所述Cas9蛋白的衍生物与所述Cas9蛋白相比具有下列突变至少之一：D10A和H840A，所述细胞进一步过表达：第二核酸分子，所述第二核酸分子编码tracrRNA，并且所述第一核酸分子具有SEQIDNO：1所示的核苷酸序列，所述第二核酸分子具有SEQIDNO：2所示的核苷酸序列，所述第一核酸分子定位于所述细胞基因组中的H3F3A基因中，所述第二核酸分子定位于所述细胞基因组中的H3F3A基因中，沿着5’端至3’端的方向，所述第一核酸分子位于所述第二核酸分子的上游，所述基因组过表达基因表达调控元件，所述基因表达调控元件为SID4X或VP64，沿着5’端至3’端的方向，所述第一核酸分子位于所述SID4X的下游，沿着5’端至3’端的方向，所...

【专利技术属性】
技术研发人员：李卓，裴端卿，
申请(专利权)人：中国科学院广州生物医药与健康研究院，
类型：发明
国别省市：广东;44